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皮肤恶性黑素细胞瘤(CutaneousMalignantMelanoma)是恶性程度极高的皮肤肿瘤，其发病率在逐年上升。近年来发现，BRAF基因在人黑素瘤中存在高频率的突变，是迄今为止在黑素瘤中发现的突变率最高的基因，但目前对BRAF基因突变在黑素瘤形成中的作用仍不明确。本课题的目的，是采用质粒介导的RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)研究BRAF突变基因在人黑素瘤发生发展中的作用。
首先，设计并合成二条针对BRAF基因编码序列的特异性shRNA寡核苷酸序列BRAF1和BRAF2，以及一条与人基因组无同源性的非特异性阴性对照shRNA寡核苷酸序列。其中BRAF1序列特异性地针对人黑素瘤中最常见的BRAFV599E错义突变。将退火后的双链shRNA寡核苷酸序列插入质粒pGensil-1的U6启动子后面，进行双酶切和基因测序鉴定。双酶切和测序结果显示，所设计的shRNA寡核苷酸序列全部被正确插入pGensil-1质粒。
在成功构建表达shRNA的质粒载体之后，采用Fugen6脂质体转染试剂将质粒转入人黑素瘤细胞系A375和M14细胞，并用含G418的培养基(400μg/ml)筛选阳性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westernblotting检测shRNA对BRAF基因的抑制效果。实验结果显示，非特异性对照质粒pNeg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰，而2条序列特异性质粒pBraf1和pBraf2不同程度的抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达，其中以pBraf1对A375细胞的干扰效果最为明显，显著减少了A375细胞BRAF基因mRNA和蛋白的表达。
最后，采用四氮唑盐(MTT)比色实验和平板克隆形成实验比较干扰前后黑素瘤细胞的体外生长和增殖情况。实验结果显示，阴性对照质粒pNeg对该2种人黑素瘤细胞的生长增殖均未产生明显影响；2条特异性shRNA质粒则不同程度地抑制了黑素瘤细胞A375和M14的体外生长和增殖能力。为了进一步研究BRAF突变影响黑素瘤细胞生长增殖的可能机制，我们采用碘化丙啶(PI)染色的流式细胞技术检测了干扰前后A375和M14细胞的细胞周期和凋亡情况。结果显示，2条特异性shRNA质粒不同程度地减少了黑素瘤细胞A375和M14的S期细胞数量。其中特异性针对BRAFv599E突变的shRNA质粒pBraf1对A375细胞的抑制效果最好，显著抑制了A375细胞的体外生长和增殖，明显减少了A375细胞处于S期的细胞数量。但所构建的3条shRNA表达质粒均对A375细胞和M14细胞的凋亡未产生明显影响。
以上结果证明，BRAFV599E突变可以促进人黑素瘤细胞的生长和增殖，其作用机制可能是通过突破G1/S期控制点，使S期细胞数量增加，从而促进瘤细胞的分裂，而不是通过抑制瘤细胞的凋亡。提示BRAF基因突变在人黑素瘤发生中具有重要作用，有望成为黑素瘤基因治疗的新靶位。