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目的
明确蛋白酶体抑制剂对人未分化甲状腺癌细胞的自噬活性的影响,并进一步探讨自噬在蛋白酶体抑制剂抗甲状腺癌中的作用。
方法
1、实验细胞:人未分化甲状腺癌细胞系FRO,于含10%胎牛血清的DMEM培养液中、37℃、5%CO2、饱和湿度下培养,2～3d传代一次,选用对数生长期细胞进行实验。
2、相差显微镜观察细胞形态;吖啶橙染色荧光显微镜观察酸性囊泡的形成;脂质体转染法建立FRO-GFP-LC3稳定转染细胞系后荧光显微镜观察自噬标记物LC3的分布;MTT比色分析法检测蛋白酶体抑制剂对细胞增殖的影响。
3、实验分组:为明确蛋白酶体抑制剂MG132对FRO细胞自噬活性的影响,设空白对照组、MG132量效组(0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM)、MG132时效组(1μM,4h、8h、12h);为明确蛋白酶体抑制剂MG132激活FRO细胞的自噬类型,设3-MA(5mM)组、wortmannin(5gM)组、MG132(2μM)组、3-MA(5mM)+MG132(2μM)组、wortmannnin(5gM)+MG132(2μM)组、饥饿诱导(EBSS)组、3-MA(5mM)+EBSS组、wortmannin(5μM)+EBSS组;为明确自噬抑制剂对蛋白酶体抑制剂MG132细胞毒性的影响,设CQ量效组(1μM、2μM、5μM、10μM、20μM)、wortmannin量效组(1μM、2.5μM、5μM)、MG132(0.5μM、2μM)组、CQ(各浓度)+MG132(各浓度)组、wortmannnin(各浓度)+MG132(各浓度)组。
结果
1、蛋白酶体抑制剂MG132对FRO细胞自噬活性的影响
相差显微镜下,MG132作用于FRO细胞可见细胞空泡状结构形成;吖啶橙染色后荧光显微镜下观察发现,MG132诱导酸性囊泡的增加(P＜0.05);荧光显微镜下观察发现,MG132作用于FRO-EGFP-LC3细胞后,绿色荧光的点簇状聚集相比空白对照组明显增加(P＜0.05)。
2、自噬抑制剂对MGl32所激活的FRO细胞的自噬活性的影响
与空白对照组相比,抑制PI3K活性的自噬抑制剂3-MA组及wortmannin组酸性囊泡或LC3的点簇状聚集均没有明显的改变(P＞0.05);相比MG132组,3-MA+MG132组及wortmannin+MG132组的酸性囊泡或LC3的点簇状聚集亦没有明显的改变(P＞0.05)。而依赖PI3K的经典自噬模型EBSS组与对照组相比LC3的点簇状聚集明显增加(P＜0.05),3-MA及wortmannin均明显抑制了EBSS诱导的LC3的点簇状聚集(P＜0.05)。
3、自噬抑制剂对MG132细胞毒性的影响
与空白对照组相比,自噬早期抑制剂wortmannin组对FRO细胞活力基本无影响(P＞0.05),与MG132组相比,wortmannin+MG132组对细胞活力的影响无统计学差异(P＞0.05);自噬晚期抑制剂CQ组对FRO细胞活力与对照组相比基本无影响(P＞0.05),CQ+MG132组对细胞活力的影响与MG132组相比亦无统计学差异(P＞0.05)。
结论
1、蛋白酶体抑制剂MG132确实诱导FRO细胞自噬的发生;
2、蛋白酶体抑制剂MG132诱导FRO细胞发生的自噬可能是PI3K非依赖的非经典自噬;
3、自噬抑制剂对蛋白酶体抑制剂MG132的FRO细胞毒性作用没有影响。