肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致肝细胞肝癌发生发展的主要因素。HBV X基因编码的X蛋白(HBx)不但对病毒自身的复制过程有很重要的作用，而且通过直接或间接作用影响宿主细胞内多种生物学过程，从而促进肝癌的发生发展。Yes-associated protein(YAP)是Hippo信号转导通路下游的效应因子，是一个重要的癌基因。YAP与肿瘤细胞的增殖和凋亡具有密切的关系，参与肝癌等多种肿瘤的形成和发展。研究发现，YAP在临床肝癌组织中高表达。到目前为止，大量研究表明HBx可以促进肝癌细胞的增殖，但其详细的分子机制尚不十分清楚。为了进一步阐明HBx促进肝癌发生发展的分子机制，本文探讨了YAP在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用。主要研究内容如下：　　 第一部分：HBx对YAP的调节作用应用免疫组织化学技术检测临床肝癌患者的癌组织及癌旁组织和正常肝组织中YAP蛋白的表达水平。结果显示，40例肝癌组织中28例呈阳性反应，阳性率为70.0％，12例癌旁组织中仅1例呈阳性反应，8例正常组织中无阳性结果。YAP mRNA在21对肝癌组织中的表达水平明显高于其癌旁组织。为了研究HBx是否调节YAP的表达，在稳定表达HBx的人肝癌细胞系HepG2-X(或H7402-X)中通过实时定量PCR和免疫印迹的方法检测YAP的mRNA水平和蛋白水平。结果显示，与对照组相比，HBx可以显著上调YAP的mRNA和蛋白表达水平。相反，用pSilencer3.0-HBx干扰HepG2-X(或H7402-X)细胞系中HBx的表达后，YAP的mRNA和蛋白表达明显受到抑制。因此，HBx可以上调YAP的表达水平。　　 第二部分：YAP基因启动子的分子克隆及其活性分析首先，通过GenBank和Matlnspector软件预测YAP基因可能的启动子序列(YAP基因转录起始位点上游-1420bp至下游+115bp)，使用引物设计软件Primer5.0设计出YAP基因启动子区域PCR扩增引物，以HepG2细胞的基因组DNA为模板，PCR扩增产物连接到T载体，测序正确后再亚克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上。在瞬时过表达HBx的人肝癌细胞系HepG2(或H7402)中，双荧光素酶报告基因检测结果显示，HBx能显著增强YAP基因的启动子活性。为了进一步证实HBx对YAP启动子活性上调作用，在HepG2-X(或H7402-X)中瞬时转染HBx的干扰质粒pSilencer3.0-HBx后，YAP的启动子活性明显受到抑制，并呈现剂量依赖性。为了筛选YAP的启动子核心区，将全长的启动子随机分为3段：P-604/+115(YAP-720)，P-232/+115(YAP-348)，P-62/+115(YAP-178)，并且将这三个片段全部克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，并分别命名为pGL3-720，pGL3-348和pGL3-178。然后，分别瞬时转染肝癌细胞系HepG2(或H7402)，报告基因结果显示pGL3-348的活性最强，提示P-232/+115片段的基因序列为YAP启动子核心区。　　 第三部分：HBx通过YAP促进肝癌细胞增殖将YAP的siRNA干扰片段瞬时转染到人肝癌细胞系HepG2-X(或H7402-X)中，应用平板克隆形成实验和MTT实验检测YAP对肝癌细胞增殖作用的影响。结果发现，转染YAP siRNA的肝癌细胞与对照组相比，细胞增殖明显受到抑制，表明YAP有促进肝癌细胞增殖的作用。　　 综上所述，本研究发现，HBx通过上调YAP的表达水平促进肝癌细胞增殖。本研究为进一步揭示HBx的致癌分子机理提供了新的实验依据，对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论价值。