研究背景和目的我国是一个“肝病大国”,各种肝病引起的急性肝功能衰竭是一种严重的临床综合征,其致死率高达60%-90%[1]。生物人工肝(bioartificialliver,BAL)作为肝功能衰竭病人的有效治疗措施及肝移植前的替代手段,受到广泛关注而成为当前研究热点[2-5]。BAL是以人工培养的肝细胞为基础构建的体外反应装置,其生物学支持作用主要来源于肝细胞的合成、代谢和解毒等功能,因此生物材料即肝细胞源是BAL的核心部分[6]。理想的BAL生物材料应具备:(1)人源性;(2)表型正常;(3)易于获得;(4)易于培养且能迅速生长至高密度;(5)具有良好的分化状态及成熟肝细胞的全部生物代谢功能[7]。但是现在尚无任何一种细胞材料能满足以上所有条件。目前常用的生物材料及缺陷主要有:(1)新鲜分离的成人原代肝细胞,具备肝细胞的所有功能,无疑是BAL最理想的生物材料,但由于来源严重缺乏,体外难以增殖,而无法实现临床普及应用。(2)异种肝细胞,主要应用的是猪肝细胞,有多种进入临床试验阶段的BAL都采用它作为生物材料,但由于可能引起异种蛋白反应和动物源性传染病,许多欧洲国家已明确禁止猪肝细胞用于BAL。(3)人源性肝细胞株,包括两种,一是肿瘤来源的肝细胞株,它们来源广泛,具有正常肝细胞的某些功能,培养后能迅速达到人工肝治疗的数量需求[8],但其潜在的致瘤危险性难以完全排除;二是基因工程技术获得的永生化肝细胞,主要通过病毒载体将SV40LT或hTERT等永生化基因导入肝细胞而构建,但是SV40LT也存在潜在的致瘤性,病毒载体还可能导致不可预知的细胞遗传障碍[9]。(4)其他,如肝干细胞,由于其分离培养及诱导分化技术尚未成熟,要进入应用研究阶段时日尚早。由于缺乏理想的生物材料,BAL技术现尚难成为可靠、有力的治疗手段,但是研究者仍然相信随着研究的不断深入,BAL最终将会为急性肝衰竭的治疗带来革命性的变化。本研究论文在既往研究的基础上,着重对如何提高人源性肝细胞株的安全性问题,提出了自己的观点,并作出了初步的探索。首先针对肿瘤来源的肝细胞株,提出了利用高分化肝癌组织或良性病变肝脏组织构建新型人源性肝细胞株;其次,针对基因工程获取的永生化肝细胞株,提出了基于piggyBac的新型肝细胞永生化载体系统;最后,我们还对硝酸纤维素(NC)膜做为BAL肝细胞源生长的支持材料的可能性进行了初步研究。总之,最终为解决理想生物材料缺乏这一制约BAL发展的问题作出努力。方法1、不同人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究。收集南方医院手术切除肝脏标本病变周围的非肿瘤组织,采用本课题组申请有专利技术的肝细胞分离器械盒(专利号:201120133192.5)进行原代成人肝细胞的分离,含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基常规条件下培养。提取12种人肝细胞株及原代成人肝细胞的RNA后,采用实时定量PCR技术检测12种肝脏功能相关基因mRNA的表达。上述细胞爬片后,通过细胞免疫荧光技术检测细胞功能相关蛋白ALB、CYP 2E1的表达,同时收集细胞培养上清采用全自动生化分析仪测定上清中白蛋白及尿素氮的含量。2、不同分化程度肝脏肿瘤组织的肝脏功能水平的比较。收集2009年1月-2011年12月期间在南方医科大学南方医院肝胆外科行外科手术切除的34例患者的肝脏组织标本,包括高分化肝癌组织12例、低分化肝癌组织12例、病变周围相对正常肝组织12例(有2例与上述肝癌组织取自同一患者)。提取组织RNA后,采用实时定量PCR技术检测上述三类组织肝脏功能相关基因mRNA的表达。同时采用免疫组织化学染色技术检测细胞功能相关蛋白ALB、CYP2E1的表达。3、新型人源性人工肝用肝细胞株的构建。细胞分离程序参照上述原代成人肝细胞的分离,培养基采用含20%胎牛血清的DMEM,0.25%胰酶消化传代。采用上述实时定量PCR技术、免疫细胞化学技术及上清检测评价肝脏功能相关指标表达情况,并与原代成人肝细胞及C3A细胞相比较。4、无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建及应用。重叠延伸PCR技术扩增 attB1-Kozak-hTERT (前端)-attB2 和 attB1-hTERT (后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,对相应大小条带切胶回收后,通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建最终目的载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo。随后将永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo和载体pCAGG-PBase共转染HL-7702细胞后,检测其hTERT基因的表达情况。5、NC膜作为BAL细胞生长支架材料的研究。将BAL用细胞材料接种于NC膜上,通过扫描电镜技术及HE染色技术观察其生长情况,流式细胞术及LDH测定评价细胞凋亡情况,免疫细胞化学技术等观察部分肝脏功能蛋白的表达情况。同时以盖玻片或培养板等普通培养介质作为对照。6、统计分析。统计学方法采用SPSS13.0软件,对于mRNA的表达水平的组间差异,方差齐性检验后行多个独立样本的非参数检验;对于计数资料采用行列表资料的X2检验;对于LDH漏出检测分析,组间差异采用两因素的方差分析;对于凋亡检测分析,组间差异采用两样本的t检验,P< 0.05被认为差异有统计学意义。结果1、不同人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究。实时定量PCR检测结果显示现有12种人肝细胞株12个肝脏功能相关基因的mRNA表达水平均远远低于原代成人肝细胞的表达水平,且不同肝细胞株之间差异较大,其中HepG2、C3A和Hep 3B2.1-7肝细胞特异性功能相对较好,尤其是合成功能,细胞免疫荧光证实了部分相关基因的蛋白水平表达,培养上清中白蛋白和尿素氮的含量与实时定量PCR检测结果基本相符。2、不同分化程度肝脏肿瘤组织的肝脏功能水平的比较。实时定量PCR检测结果显示肝脏合成、代谢和解毒相关的12个基因的mRNA表达水平除GST-π外,高分化肝癌组织、低分化肝癌组织和癌旁组织之间差异具有统计学意义(X2≥16.635, P<0. 001),而且癌旁组织高于高分化肝癌组织高于低分化肝癌组织。免疫组化检测肝细胞特异性功能相关蛋白ALB、CYP2E1的表达情况与实时定量PCR检测结果基本相符。3、新型人源性人工肝用肝细胞株的构建。利用高分化肝癌和良性病变肝脏组织分别构建两株BAL用肝细胞材料,分别命名为NHBL1和NHBL2。NHBL1细胞经实时定量PCR检测显示在12个肝脏功能相关基因中,GST-π的mRNA表达水平比C3A细胞略高,但其他指标均不同程度的低于C3A细胞,其中相差在1倍之内的有AAT、TF、G6P,2倍之内的有ALB、TTR、CYP 3A4,5倍之内的有CPS-1,CYP 3A,其他指标差距均超过5倍。培养上清中单细胞ALB生成量分别为 2.200×10-5g/L,0.277×10-5g/L,0.496×10-5g/L,BUN 生成量分别为 1.965×10-5mmol/L 0.109×10-5mmol/L, 0.237×10-5mmol/L。NHBL2 细胞来源为36岁男性肝癌患者的癌旁肝组织,已传25代。通过实时荧光定量PCR分析,我们发现ALB,ATT, TF,TTR,TAT和CYP3A4的水平比C3A细胞略低,其他六个指标均高于C3A细胞。4、无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建及应用。PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列与GenBank报道一致,并将其与载体pCAGG-PBase成功转染至HL-7702 细胞。5、NC膜作为BAL细胞生长支架材料的研究。扫描电子显微镜下NC膜的形态:低倍镜下NC膜表面较为平整光滑,高倍镜下NC膜呈现海绵样空间立体结构,膜孔径精确度高,具有均一的孔径。HE染色并透明处理后镜下观察细胞在NC膜和玻片上呈现高贴壁状态,细胞逐渐增殖,细胞形态一致,扫描电镜下也呈现出类似的表现。生长在NC膜上细胞的凋亡情况与普通介质之上的无明显差异(F=0.267, P=0.609)。免疫细胞化学染色显示功能相关蛋白仍正常表达。结论1、研究中认为现有各种人源性肝细胞株与理想BAL生物材料的差距仍较大,主要是高度恶性肿瘤组织来源,安全性顾虑较大,而且功能上还远远无法达到正常成人肝细胞的水平。2、研究中筛选出两株高分化肝癌和良性病变肝脏组织来源的细胞株,功能水平接近于C3A细胞,但一定程度上降低了应用的安全性顾虑,同时也为构建新型人工肝细胞材料提供了一种新的思路。3、研究中建立了一种基于piggyBac转座酶的新型肝细胞永生化载体系统,与传统永生化技术相比主要优势在于无病毒载体的参与,因而更适于下一步的临床应用。4、研究中初步论证了 NC膜对BAL用细胞材料生长的支持作用,为新型人工肝支持系统生物反应器的构建提供了实验依据。