包括神经退行性病变在内的多数中枢神经系统疾病均可能与外周炎症过程相关。炎症虽可作为机体抵抗外来刺激的防御性反应,但过度的炎症反应也可造成组织损伤,推动疾病发展。外周炎症过程可导致如发热、厌食等病理反应,提示特定炎症物质可将外周炎症信号传递至中枢神经系统。但这种炎症信号对脑内特定部位,如与认知、学习记忆相关的大脑皮层和海马等区域,是否也有影响,并导致相关的病理改变,其机制如何,至今未见系统报道。腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)炎症模型中,花生四烯酸代谢产生的炎症物质前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和白三烯C4(leukotriene C4, LTC4)作用于下丘脑相关脑区,诱导发热、厌食等症状。由于该类炎症物质可在脑内广泛产生并易于扩散,因而推测,它们也可作用于大脑皮层及海马等与认知、记忆功能密切相关的脑区,并可能作为始动因素诱发下游病理改变。然而,在整体炎症模型中,大脑皮层及海马脑区内PGE2和LTC4的生成及其合成酶系表达情况至今未见系统报道,亟需展开相关研究。本研究第一部分采用LPS腹腔注射致脑炎模型,探索致炎后大鼠大脑皮层及海马内该两炎症物质的生成情况,并以环氧合酶抑制剂吲哚美辛(indomethacin, INDO)作为工具药,研究PGE2调控大脑皮层及海马中3-硝基化酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)形成,从而论证PGE2作为始动因素推动脑内相关病理改变的作用。另一方面,炎症过程诱导生成肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α), TNF-α参与各种急、慢性中枢神经系统炎症反应。相关研究表明,TNF-α信号通路可上调BACE1表达造成海马脑区内淀粉样蛋白生成增加,进而推动阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发展。BACE1直接参与淀粉样肽(amyloidb,Aβ)形成,因而是一种具有重要病理意义的标志性蛋白。本研究第二部分采用LPS腹腔注射致脑炎模型及体外培养神经元、星型胶质细胞体系,以TNF-α抑制剂依那西普(etanercept, ETC)为工具药,论证TNF-α信号通路干预BACE1表达的作用及其机制。本研究利用体内、外多种炎症生物学体系,系统研究以PGE2、TNF-α为主的炎症物质对大脑内调控情况,既关注以大脑皮层,海马等病理学改变为特征的早期病理学靶点,又关注论证"PGE2-ONOO"-3-NT/BACE1"炎症事件,以期揭示炎症过程推动脑内病理改变的生物学本质,为寻找神经退行性改变相关的药物作用新靶点提供思路。1.LPS致大鼠大脑皮质海马PGE2、LTC4合成酶系表达变化及3-硝基酪氨酸形成探索LPS致大鼠脑部炎症模型中,大脑皮层及海马区域PGE2和LTC4合成酶系表达及产物生成情况,并论证其对脑内病理改变的影响。LPS (2 mg/kg, i.p.)可致雄性成年SD大鼠体温升高,幅度、时相均与文献报道相符,提示脑部炎症造模成功。大脑皮层、海马组织mPGES-1于24 h内呈时间依赖性表达上调,脑微血管内皮细胞及锥体神经元均可见其表达,PGE2水平同步增高；另一方面,LPS作用1 h后,在基因、蛋白水平,均可见大脑皮层及海马内LTC4S均呈现一过性上调,并伴随LTC4合成能力增强。mGST3表达未受LPS作用影响,未检测出上述脑区内mGST2的表达。一氧化氮合酶(nitric oxide synthases, NOSs)及NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOXs)是体内催化NO及ROS的主要酶系。研究发现,LPS致炎1d可导致海马组织内皮型及诱生型NOS (eNOS, iNOS)及神经元特异性NOX4蛋白表达上调,提示海马组织生成NO及ROS。两者反应生成亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-),并导致3-NT形成,该过程与AD发病密切相关。免疫组化结果表明,LPS致炎7d可致大鼠海马组织3-NT水平显著上调,提示上述炎症过程可在早期启动或促进AD病程。诱导细胞凋亡是3-NT重要下游毒性机制之一，western blot结果显示,LPS致炎7d伴随海马组织凋亡相关蛋白caspase-8及Bax表达上调。提示3-NT形成可能通过多种途径参与启动细胞凋亡过程。INDO预给药,可抑制LPS引起的动物发热,并部分抑制LPS所致海马组织eNOS、iNOS及NOX4上调,进而缓解海马部位3-NT形成,及caspase-8及Bax上调,提示炎症物质PGE2参与调控NO及ROS生物合成,并经由3-NT诱导的细胞凋亡影响细胞存活。细胞丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信号通路可在早期参与AD相关的多种分子生物学事件调控。研究发现INDO可在极早期显著抑制LPS诱导的ERK1／2磷酸化激活,但未见其对p38磷酸化水平调控,提示PGE2可能经由激活ERK1／2信号通路参与对iNOS表达调控,而p38信号通路未体现介导PGE2相关的下游分子事件。本研究结果表明,外周注射LPS致大鼠脑部炎症模型中,大脑皮层及海马脑区内PGE2及LTC4合成酶系表达发生变化,提示该两炎症物质存在于上述脑区。外周LPS炎症刺激通过诱导PGE2生成,上调海马脑区内NOSs及NOX4表达变化,进而促进3-NT形成,并诱导细胞凋亡倾向增加,提示PGE2作为重要早期因素参与3-NT形成。MAPKs信号通路与上述调控过程有关。2.LPS致大鼠炎症经由TNF-α调控星型胶质细胞淀粉样前体蛋白p位剪切酶表达及机制研究本研究探索炎症介质TNF-α、PGE2对BACE1表达的调控作用。LPS (2 mg/kg, i.p.)可导致大鼠海马组织内BACE1 mRNA、蛋白表达、活性及其酶切产物分泌型淀粉样蛋白β(secreted APPβ, sAPPβ)呈时间依赖性上调。免疫荧光化学复染结果显示,上调BACE1与星型胶质细胞标志蛋白纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)高度重合。该结果表明,LPS致大鼠脑部炎症过程中,海马部位星型胶质细胞与上调BACE1密切相关,提示该炎症过程可能经由上调BACE1这一AD病程中的早期关键蛋白推动病程发展,其中星型胶质细胞是介导该作用的主要细胞类型。进一步论研究显示,预给予ETC (5 mg/kg, suc.)可显著降低LPS所致大鼠海马组织BACE1蛋白及sAPPβ表达上调；蛋白定位结果显示,上调的BACE1集中表达在星型胶质细胞中,而不与神经丝表达阳性的神经元共表达。以上结果提示了TNF-α信号通路及星型胶质细胞在LPS所致BACE1上调过程中的重要作用。为进一步验证上述结果,将体外培养原代大鼠大脑皮层星型胶质细胞及神经元与TNF-α共孵育。结果表明,TNF-α在10-150 ng/ml范围内,可浓度依赖地上调星型胶质细胞中BACE1蛋白表达,而同浓度TNF-α不影响神经元中BACE1蛋白表达。体内、外实验均提示,TNF-α可通过调控星型胶质细胞中BACE1表达,影响AD病理过程。由于INDO (2 mg/kg, i.p.)未能影响LPS所致大鼠海马BACE1表达上调,提示PGE2并未参与炎症刺激下BACE1表达调控,间接映证了TNF-α对BACE1表达的重要调控作用。TNF-α可诱导脑内星型胶质细胞激活、增殖,提示星型胶质细胞中TNF-α信号通路与AD发病密切相关。本研究发现,LPS诱导外周炎症过程中产生的炎症因子TNF-α参与上调星型胶质细胞中BACE1蛋白表达。体外实验结果支持TNF-α信号通路及星型胶质细胞在AD发病过程中的重要作用。以上实验表明：1.外周注射LPS致大鼠体温升高急性时相内,大脑皮层及海马组织及微血管内皮细胞内mPGES-1表达上调,PGE2水平增加；LTC4S呈现一过性表达升高,未见其同工酶mGST2表达,mGST3表达未受LPS影响。提示腹腔注射LPS可诱导大脑皮层及海马脑区mPGES-1和LTC4S活性增加,产生炎症因子PGE2及LTC4。2.外周注射LPS可导致海马组织NOSs、NOX4表达依次上调,NO、ROS水平升高,形成3-NT,并诱发凋亡蛋白表达。INDO可部分抑制上述变化,提示炎症物质PGE2可能作为重要的早期因素参与该病理变化过程。3.LPS可致海马内APP剪切酶BACE1表达上调,酶活力和酶切底物sAPPβ均增加,体内外实验均表明TNF-α选择性调控神经组织星型胶质细胞中BACE1表达,提示星型胶质细胞中的TNF-α信号通路在促进AD早期病程中发挥重要作用。