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单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)作为新一代的遗传标志物,被作为评估疾病易感和药物响应的重要因子。如载脂蛋白E (Apolipoprotein E,ApoE)具有与脂质和受体结合的功能,不但在脂质代谢中起关键作用,同时也参与神经系统的正常发育生长过程及其损伤后修复,其基因多态性与心血管疾病以及神经退行性疾病,如阿尔茨海默症(Alzheimer disease, AD)的相关性备受关注。磷脂酶(A1、A2、B、C和D)可特异地作用于磷脂分子内部的不同酯键,通过不同产物的形成调节脂类代谢。磷脂酶D3 (Phospholipase D3, PLD3)基因2014年被报道是欧洲人群新发现的AD易感基因,其罕见突变V232M和A442A可将个体生命后期患阿尔茨海默氏症的风险提高2倍。随着我国老龄化加剧和慢病检测和管理的亟需,对大样本人群开展疾病易感基因的筛查,不仅能获得针对中国人群特定基因位点与疾病相关的数据库,还可达到疾病预防的目的,节约大量的医疗资源。而建立快速、准确、经济且适于各级医疗机构的通量SNP分型技术显得尤为重要。基因分型常用方法包括测序、实时荧光定量PCR、基因芯片杂交、质谱等,这些方法具有通量高,准确,灵敏度高等优势,但对于临床样本分析依然存在仪器设备昂贵,检测周期长,操作过程繁琐,对检测人员的专业技术要求高等不足之处。近年来,基于纳米粒子的DNA检测技术发展迅速,纳米颗粒和层析技术的联合应用,可以实现目视化检测目的DNA。本研究采用团队发明的PCR-金磁微粒层析技术,建立了ApoE口PLD3的基因分型检测方法,对临床相关疾病的全血样本进行了SNP检测,为进一步开展易感基因的筛查奠定了基础。研究目的以纳米金磁微粒为载体,构筑便捷准确的等位基因特异性PCR (AS-PCR)产物检测的快速层析系统,将其用于ApoE基因分型和PLD3基因罕见突变检测系统的构建。收集相关临床样本,对阿尔茨海默症以及缺血性脑卒中患者的基因型进行筛查,并探讨基因多态性与疾病易感性之间的相关性,为疾病的临床诊断提供分子生物学指标。方法及主要研究结果方法学的建立：以课题组自主研发的GoldMag(?)金磁微粒为载体,结合双重AS-PCR,建立能够快速准确检测SNP的方法,即PCR-金磁微粒层析法(PCR-GoldMag Lateral Flow Assay)。主要包括两步,首先通过双重AS-PCR获取待测SNP位点的等位基因特异性产物,其通用引物的5’端修饰生物素,野生型和突变型特异引物的5’端分别修饰地高辛和异硫氰酸荧光素。在SNP位点的单管双重AS-PCR扩增产物的基础上,进行双试纸条检测。试纸条的质控线(C线)和检测线(T线)分别喷涂链霉亲和素和羊抗鼠IgG; WT检测试纸条和M检测试纸条结合垫上的金磁微粒探针分别标记有抗地高辛抗体和异硫氰酸荧光素抗体。扩增产物上样,10 mmin肉眼即可判读结果。对层析系统各个参数进行了系统的优化,并与测序法进行了对比,结果证明该方法能够准确地判断SNP基因型。研究结果：1.构建ApoE基因分型的PCR-金磁微粒层析系统。针对ApoE*4 (rs429358T>C)及ApoE*2 (rs7412 C>T)位点进行引物设计及修饰,利用双重AS-PCR分别获取各位点的等位基因特异性扩增产物,带有不同修饰的PCR产物与层析试纸条中的金磁微粒免疫探针特异性结合,通过层析反应实现ApoE基因的快速分型。对该分型系统进行优化并引入了尿嘧啶-N-糖基化酶(JNG)-dUTP的防污染体系,性能评估结果表明：ApoE基因分型系统具有良好的特异性,检测限达到10ng(基因组DNA)。利用建立的ApoE基因型检测系统,选用测序法作为对照,对300例临床样本进行双盲检测。结果表明：PCR-金磁微粒层析法检出率明显高于测序法,具有更高的检测灵敏度,方法的准确度也达到了测序法的水平。2.采用病例对照研究,选取年龄和性别相匹配的北方汉族53例散发性阿尔茨海默病(AD)患者、130例缺血性脑卒中(IS)患者和105例健康者为研究对象。对检测结果统计分析：对于AD易感性的研究中,ApoE各基因型分布在AD和对照组间差异极显著(P<0.01),E4等位基因在两组间的分布具有统计学意义(P<0.01),经风险评估,OR值为5.41；对于IS易感性的研究中,E4等位基因在IS患者中的携带率较对照组显著升高(P=0.024),且E4等位基因携带者IS易感性明显增高,差异具有统计学意义(E4 vs E3:OR=2.19,95%CI. I.092-4.390)。临床样本的研究结果支持ApoE的E4等位基因为中国北方汉族人群AD和IS的易感基因。3.构建PLD3基因分型的PCR-金磁微粒层析系统,主要用于筛选突变V232M及A442A。对100例临床样本进行双盲检测,经与测序结果比对,完全吻合,证明了方法学的可靠性。进一步在53例AD患者和105例健康者进行的应用,初步探讨V232M及A442A作为AD易感基因的潜在可能性。结果显示,仅检测到1例A442A突变(且存在于对照组),表明PLD3这两个突变在中国人群中发生的概率比较低,在欧洲人群得到的PLD3罕见突变与AD易感性的关联结果尚需在我国进行大量临床样本的验证。本课题以纳米金磁微粒代替传统胶体金作为标记,建立了用于两个特定基因SNP分型的PCR-金磁微粒层析技术,通过引物的设计筛选,保证了方法的特异性；金磁微粒优于胶体金的特性,实现了较高的检测灵敏度。在临床样本的检测过程中,其检测准确度与测序法高度一致,此外,样本的检出率高于测序技术。初步的临床应用结果证明,该方法操作简便、灵敏度高、特异性强,且结果客观易于保存。检测仅需规范的PCR实验室即可完成,无需昂贵的仪器,适合用于临床推广,对疾病易感基因的筛查与临床防治和慢病管理意义重大。