APP外膜脂蛋白基因克隆、原核表达及免疫原性初步研究

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是革兰氏阴性无芽胞的短杆菌,目前已发现15个血清型。APP可以起猪的传染性胸膜肺炎(Porcineinfectious pleuropneumonia)。该病以呼吸困难、肺出血性坏死和纤维素性粘连为主要特征,死亡率较高,易与其它病原微生物混合感染。APP的是一种多毒力因子病原,其毒力因子很多,现已发现与APP的致病性有关的毒力因子包括荚膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、外膜脂蛋白(OMLA)、转铁结合蛋白(TBP)、溶血外毒素(Apx)、蛋白酶、渗透因子、粘附因子、菌毛、尿素酶等。根据GenBank基因序列号为U86675血清型1型APP OMLA基因序列,设计并合成了特异性引物,采用PCR技术,以APP细菌DNA为模板,扩增出OMLA基因,将基因连接到pMD18-T载体上并测序,测序结果表明其开放阅读框有1095个碱基,编码364个氨基酸。将OMLA基因核苷酸序列及推导氨基酸序列与其他已报道的OMLA基因进行同源性比较、变异分析,结果显示,OMLA基因核苷酸序列与1型、9型和11型同源性为100%,与2型、3型、4型同源性分别为76.2%、63.3%、63.8%,与5型、6型、7型同源性分别为62.5%、63.3%和64.4%,与8型、10型和12型同源性分别为77.3%、62.2%和98.6%。OMLA基因编码的氨基酸序列与1型、9型和11型同源性为100%,与其他血清型同源性分别为62.2~98.6%。以pMD18-OMLA为模板,扩增出成熟蛋白的编码基因(1032bp),并将其插入pET-32a(+)表达质粒,构建了pET32a(+)-mOMLA成熟蛋白原核表达质粒。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组成熟蛋白,SDS-PAGE,Western-blot证实表达出60kD左右的融合蛋白,并检测其可溶性。试验确定OMLA重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.4mmol/L,37℃诱导培养4h,在最佳表达条件下,重组成熟蛋白表达的相对含量可达到47.5%。重组成熟蛋白纯化复性后,分别以重组蛋白、重组蛋白与灭活APP、灭活APP以及PBS与等量的佐剂乳化后免疫小鼠,期间用间接ELISA方法检测抗体效价,在免疫三次后,用5×LD50的APP血清1型菌对小鼠进行攻毒。结果表明,重组蛋白具有一定的免疫原性,可刺激机体产生较高水平的抗体(>1:3200),免疫后的试验动物对同型APP的感染具有一定的保护力。
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