目前,肺癌仍是世界范围内致死率最高的恶性肿瘤,其生物学行为及调控机制繁复庞杂,继续深入研究肺癌的发生发展机制有重要的科学意义。建立原代肺癌细胞系有助深入探究肺癌发生发展的分子机制,为癌症的诊断和治疗提供新的靶点。癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblast,CAF)是一种重要的肿瘤基质细胞并参与肿瘤微环境的构成,对肿瘤细胞的迁移和侵袭以及耐药性有着非常重要的作用。但目前对于CAF促进肿瘤发生发展过程的具体机制尚不清楚,有待深入研究。本文主要开展了肺癌原代细胞与CAF的分离与培养,并初步分析了CAF促进肺癌细胞增殖和迁移的分子机制。(1)肺癌原代细胞及CAF的分离培养采用组织块贴壁法与酶解消化法从新鲜肺癌组织样本中分离肺癌原代细胞及CAF。使用不同的培养基并添加细胞因子来进行培养以提高细胞贴壁和存活率,但最终未能成功分离培养出可稳定传代的肺癌细胞。10例肺癌组织样本中,CAF的培养成功率>50%,推测可能与CAF活跃的增殖特性以及顽强的生存能力有关。(2)肺腺癌CAF的鉴定采用相差显微镜观察分离获得的肺腺癌CAF,其形态为长梭形,与呈多角形的肺癌细胞系A549明显不同。采用间接免疫荧光实验鉴定癌相关成纤维细胞,在荧光显微镜下观察到其表达CAF标志物波形蛋白(vimentin)和纤粘蛋白(fibronectin),但不表达肺腺癌细胞特异性标志物角蛋白8/18,证明成功分离获得了肺腺癌CAF。(3)肺腺癌CAF的增殖特性分析采用CCK-8试剂和流式细胞周期分析CAF与A549的生长特性。CAF与A549的增殖曲线均为S型,生长特性近似,表明CAF是肺腺癌组织中高增殖特性的细胞群体。流式细胞周期分析结果表明,肺腺癌CAF的S期细胞比例明显高于A549,说明CAF的DNA等分子合成较为旺盛;而A549的G2/M期细胞比例明显较高,表明A549的增殖速度较快,这与前述的细胞增殖分析结果吻合。(4)CAF促进肺癌细胞的增殖和迁移制备CAF条件培养基,使用CCK-8试剂分析CAF条件培养基对A549增殖的影响。结果表明,相较于无血清的DMEM培养基,CAF条件培养能够明显促进A549增殖,提示CAF在生长过程中的分泌物质可促进肺癌细胞A549的增殖。以非接触式共培养的方式,通过伤口愈合实验以及Transwell迁移实验,分析CAF对A549迁移能力的影响。结果表明,A549与CAF共培养时,CAF能够促进A549的迁移。该部分结果提示,肺癌CAF可以促进肺癌细胞的增殖和迁移。(5)CAF对肺癌细胞基因表达的影响采用定量RT-PCR技术检测了肺腺癌细胞A549与CAF共培养后与肿瘤增殖和迁移相关的关键基因表达的变化。定量RT-PCR结果表明,无血清非接触式共培养72 h后,PRR11以及STAT3潜在靶基因c-Myc、PIM1、SOCS3和CCND1的表达水平明显升高,IRF1基因的表达水平明显降低;直接接触式共培养后,STAT3、IL-6、SOCS3、CCND1、Snail、Zeb1基因水平显著提高。该部分结果提示CAF很可能通过激活肺癌细胞的STAT3通路而促进肺癌细胞的增殖与迁移。总之,本研究从肺癌组织中成功分离获得CAF,对其增殖特性进行了分析,同时发现肺癌CAF能促进肺癌细胞的增殖与迁移,该效应可能与CAF激活肺癌STAT3通路有关。本研究为进一步探索CAF在肺癌中的作用及机制奠定了良好基础。