BpNAC090转录因子调控白桦耐旱的分子机制

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NAC转录因子(TF)家族是植物中特有的一类转录因子,包含大量成员。NAC转录因子主要参与调节植物生长发育的许多生物学过程,包括对外界胁迫的响应,植物形态的形成,植物衰老调节和果实发育等。本论文研究了白桦(Betula platyphylla Suk.)响应干旱的基因调控网络的顶层调控基因BpNAC090,并进一步揭示其耐旱功能。主要研究结果如下:(1)使用20%PEG6000模拟干旱条件,通过分析BpNAC090基因表达模式发现,白桦BpNAC090受干旱胁迫3 h时表达量最高,然后开始下降,但胁迫时间内均为上调表达。BpNAC090主要在根和叶中表达,这说明其在白桦的干旱胁迫应答中起作用。(2)通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法获得BpNAC090过表达和基因敲除的白桦植株,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)对转基因白桦进行表达量分析,挑选表达量最高的OE1、OE2和OE5株系并对其进行Western Blot分析,显示该基因已经转化到白桦中并正常表达。利用CRISPR-Cas9系统获得了BpNAC090基因敲除株系,并将对nac1、nac2和nac3用于进一步研究。将过表达和基因敲除株系进行干旱胁迫,用野生型白桦作为对照。胁迫后,野生型和nac1、nac2以及nac3均已干枯且部分叶片已经脱落,但OE1、OE2和OE5虽有部分叶片发黄,但依旧存活,复水12天后,野生型和nac1、nac2以及nac3无任何变化,但OE1、OE2和OE5已经恢复生长。BpNAC090基因能够减少丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和过氧化氢(H2O2)含量及电解质渗透率,提高过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,提高脯氨酸(proline)含量,进一步的研究发现BpNAC090能够诱导POD、SOD以及脯氨酸合成相关基因的表达,从而提高白桦的耐旱能力。(3)对干旱胁迫下的BpNAC090转基因植株进行转录组测序(RNA-Seq)和染色质免疫共沉淀技术测序(Ch IP-Seq)联合分析发现其直接调控的上调表达基因有51个,下调表达基因有66个,并通过酵母单杂交、凝胶电泳迁移实验(EMSA)发现BpNAC090可以结合EOMES2(“AACACC”)、ABRE(“CACGTG”)和Tgif2(“TGTCA”)元件,并且BpNAC090对上述三个元件的结合能力均被干旱胁迫所诱导增强。随机从BpNAC090诱导表达基因中挑选11个进行Ch IP-PCR和Ch IP-q PCR分析,结果发现这些基因的启动子均可以被BpNAC090结合。从中随机选择了5个基因,通过瞬时转化体系验证表明它们均具有耐旱性。(4)干旱胁迫下BpNAC090可以与EOMES2、ABRE、Tgif2元件结合来调控下游靶基因,该过程受磷酸化(phosphorylation)调控。干旱处理可以使BpNAC090的第205位丝氨酸(Ser205)被磷酸化,使其具有耐旱性,而将该位点突变成丙氨酸(Ala)后发现磷酸化水平消失,将该突变位点稳定转化白桦发现,其对干旱胁迫的耐受性明显减弱,并且与EOMES2、ABRE和Tgif2元件的结合能力变弱,因此该位点对于BpNAC090响应干旱胁迫十分重要。(5)BpNAC090无转录自激活活性,与蛋白激酶Bp SRK2A互作,进而使BpNAC090蛋白发生磷酸化。(6)建立了一个新的DNA结合蛋白质鉴定技术Reverse-Ch IP-d Cas9-Strep,并利用该技术鉴定出了BpNAC090的上游调控因子Bpb ZIP16、Bp C3H14、Bp AGL11、Bp WHY1和Bp Ge BP。通过Ch IP及RT-q PCR研究发现这些转录因子都可以结合到BpNAC090启动子并诱导其表达。本实验系统地揭示了BpNAC090基因调控白桦耐旱的分子机制,为阐明白桦抗旱分子机制及创制高抗白桦提供了重要数据。
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