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短喙与矮小综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）自2015年爆发以来,对我国樱桃谷鸭养殖业造成了很大损失,感染鸭以体型矮小、喙短、站立行走困难为特征。新型鹅细小病毒（Novelgooseparvovirus,NGPV）为SBDS的病原。先前研究显示,早期的NGPV分离株与2019年后的分离株在樱桃谷鸭胚适应性上存在明显差异。NGPV在田间流行已有七年,近年来的流行株是否产生新的变异尚不清楚。非结构蛋白Rep1在NGPV致病性和SBDS特征性临床症状的呈现上发挥决定性作用,对Rep蛋白开展深入研究对揭示NGPV致病机制十分关键。本论文研究中,对2021-2022年的NGPV分离株进行了基因组测序和遗传进化分析,对Rep1蛋白全长及其亚片段开展了基于原核系统的表达并研制了针对表达产物的多克隆抗体,研究结果为进一步探究NGPV致病性和致病机理奠定了基础,具体内容如下:一、三株NGPV的分离、定序及遗传进化分析从2021-2022年间收集的三份疑似SBDS阳性的组织样品,通过接种樱桃谷鸭胚,分离到三株NGPV,分别命名为SDDY21、SDJN21和SDWF22株。三株病毒传代后稳定在69-142 h内致死鸭胚。SDWF22株第三代鸭胚传代毒的ELD50为5×105 26/mL,非常接近于2019年分离株SDJN19（5×105.5/mL）,而明显高于2016年分离株SDHT16（5×102.5/mL）。三个分离株的基因组均由5 054个核苷酸组成,这三个分离株与2019年NGPV分离株SDLC19和SDJN19的同源性为99.5%-99.8%,而与2016年分离株SDHT16的同源性略低,为98.7%-98.8%。三个分离株的末端倒置重复序列（Inverted terminal repeats,ITR）均由418个核苷酸组成,与SDJN19株ITR的同源性均为100%,而这四个毒株的ITR与2016年分离株SDHT16和AH1605的同源性略低,分别为98.1%和98.6%,后者的ITR由416个核苷酸组成。三个分离株的Rep1编码框均由1 884 nt组成,彼此同源性高达99.9%-100%。三个毒株Rep1蛋白与2015-2016年NGPV分离株的核苷酸同源性略低,为98.9%-99.1%,与2019年分离株SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%;相比之下,三个毒株与经典型GPV的Rep1蛋白核苷酸同源性仅为96.0%-96.8%,其中同源性最高的为来自匈牙利的GPV B株,同源性为96.8%。Rep1蛋白氨基酸序列比对显示,与经典型GPV毒株相比,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株呈现出11个特征性的氨基酸点突变。三个新分离株,除了与其它NGPV毒株具有一致的特征性氨基酸位点外,还在7个位点上形成了自身的特征性氨基酸,而2019年分离株在这些位点上的氨基酸则呈现出过渡特征。SDDY21、SDJN21、SDWF22三个毒株的VP1 蛋白均由2 199个核苷酸组成,彼此间核苷酸同源性为99.7%-99.8%,与SDJN19和SDLC19的同源性为99.5%-99.8%,与 2015-2016 年间的 6 个分离株（JS1、SDLC01、AH1605、AH0606、QH15 和 ADHT16）的同源性为98.6%-98.9%。相比之下,这三个新NGPV分离株与大陆和台湾地区经典GPV毒株的VP1核苷酸同源性仅有94.4%-94.8%,而与欧洲的GPVB株的同源性则略高,为96.0%-96.1%。进一步的氨基酸序列比对显示,包括三个新分离株在内的共15个NGPV毒株与经典型GPV毒株之间具有14个特征性氨基酸差异,在这些差异氨基酸位点中,有9个位点（28、35、41、207、210、524、537、575和703位）与欧洲的B株相一致。结果提示,流行于我国樱桃谷鸭中的NGPV更有可能在欧洲的B株基础上演变而来。以Rep1和VP1构建的遗传发生树均显示所有NGPV毒株形成了不同于经典型GPV的独立分支,但同时也显示,三个新分离株与2019年的分离株处于一个亚分支,而SBDS爆发早期的分离株则处于另一个更为紧密的亚分支。二、NGPV Rep1蛋白及其亚片段的原核表达和多抗制备NGPV与经典型GPV的Rep 1蛋白之间存有特征性氨基酸差异,Rep 1蛋白在NGPV致病性上发挥关键作用。Rep1蛋白的N端和C端分布有不同的功能结构域。原核系统表达Rep1蛋白的研究已多有报道,但大多以包涵体状态存在。本研究中,通过对表达载体、诱导温度、IPTG浓度进行试验比较,最终选择以pET-28a载体表达Rep1的N端200个氨基酸片段（后文简称为Rep1N）,以pGEX-6p-1为载体表达Rep1蛋白及Rep1蛋白的C端200个氨基酸（后文简称为Rep1C）。三个蛋白均在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了可溶性表达。三个蛋白组分分别融合了 His标签和GST标签,利用这一特性对重组融合蛋白进行了亲和纯化。以纯化蛋白作为免疫原,经弗氏佐剂乳化后分三次免疫ICR小鼠,分别制备了针对Rep1、Rep1N和Rep1C的多克隆血清抗体。以先前培育的GPV细胞适应株SYG61v-C40感染鹅胚成纤维细胞（Gooseembryo fibroblasts,GEF）,三个蛋白的多抗在间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）中均能识别在GEF中复制的GPV Rep蛋白抗原,表明制备的多抗与Rep蛋白具有较好的反应原性。通过对前体mRNA的选择性剪接,Rep1 ORF还能够产生Rep1蛋白外的其它较小分子量的Rep蛋白组分。本研究进一步以三个多抗作为一抗,通过Western-blot鉴定GPV感染GEF中的Rep蛋白组分。结果显示,Rep1和Rep1C多抗能够识别出清晰的两个蛋白条带,分子量大小约在72 kDa和53 kDa,分别对应Rep1和Rep2蛋白。由于Rep2缺失了 Rep1蛋白N端166个氨基酸,Rep1N多抗仅识别出Rep1一条带,不能识别出Rep2蛋白,经分析与预期完全吻合。总之,本研究明确了三个新NGPV分离株与2019年分离株之间呈现出更紧密的进化关系和相近的病毒滴度。对Rep1蛋白及其功能区亚片段实现了可溶性表达,制备的多克隆抗体能够识别GPV复制中的Rep蛋白组分。本论文研究结果为进一步分析NGPV的遗传进化和揭示NGPV致病机理奠定了新的基础。