在目前肿瘤治疗的传统疗法不尽如人意的情况下，肿瘤的基因治疗给人们带来了新的希望。但是，基因治疗的理论和技术仍需进一步完善和成熟，包括提高基因治疗的效率和特异性，以便能够通过便捷的操作导入目的基因、高效杀死肿瘤细胞而对正常细胞没有不良影响。细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞在受到生理或病理性刺激后发生的自发死亡过程，凋亡的发生是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，现普遍认为caspase-3是哺乳动物细胞凋亡过程中的关键蛋白酶。正常情况下，胞浆中caspase-3以无活性的酶原形式合成，包括N端的原结构域、大亚基和小亚基组成，须经上游的起始caspase等作用后才能够被加工成为有活性的caspsse-3分子。研究表明，将caspase-3的大、小亚基编码序列颠倒，翻译产物中小亚基C端和大亚基N端通过一段连接肽共价连接来构建的一种重构型caspase-3分子的基因编码产物在体外具有催化活性。本研究据此构建了上述重构 第四军医大学博士学位论文型caspase上分子，进一步将其与抗肿瘤特异性抗原erbBZ单链抗体 e23scFv、PE转膜结构域连接，并在 5’端连有一段信号肽，构建了immunocaspase上基因。 将重构型caspase上分子瞬时转染人乳腺癌细胞系SKBr3，HE染色观察发现，转染后第二天开始有较典型的凋亡细胞出现，随着时间的推移凋亡细胞逐渐增多，至第4天已形成了大量的凋亡小体。在转染后第2天即通过流式细胞仪检测出较明显的凋亡峰。重组质粒注射SKBr3荷瘤裸鼠自体对照实验，TU’uEL检测证实细胞发生了凋亡。由此可见，本实验室构建的重构型c卿ase3分子在体内、外都可以显著诱导肿瘤细胞凋亡。 将iltlllll unoc呷ase上基因转染几次at细胞获得阳性克隆，收集培养介质用于 Hela、SKBr3以及 SKOV3等细胞的培养，Mry法及细胞计数检测发现在含有inununcaspase上蛋白的培养介质中，SKBr3、SKOV3细胞的生长受到了明显抑制，大量细胞被Jurka细胞分泌的innnunocaspase了蛋白杀伤，细胞数量持续减少。而Hela细胞的生长则基本不受培养介质的影响，生长状况良好，细胞持续增殖。再以该转染细胞尾静脉注射SKBr3荷瘤裸鼠，观察发现治疗组裸鼠肿瘤生长速度明显减缓，间接免疫荧光染色检测发现重构型c卿ase上 蛋白特异性分布于肿瘤组织。证明imrnunocaspase习蛋白可在体内、外靶向杀伤erbBZ抗原阳性的肿瘤细胞。 目的基因的转移是基因治疗的核心技术之一，因此始终是基因治疗研究的重点和热点。目前的基因治疗临床应用项目中使用最多的前3种载体依次为：逆病毒载体（占总病例数的50．2％）、腺病毒载体（占总病例数的 18人％）和脂质体（占总病例数的 2 第四军医大学博士学位论文门．7％）。逆病毒载体使用较早，发展比较成熟，便于个体化操作。腺病毒载体则因其贮存的便利性更有利于商品化，但如何减少其免疫原性仍旧是一个不可忽视的问题。脂质体操作简单，无免疫原性，但基因转移效率低。 本文将immunocaspase上基因分别克隆入上述三种不同的载体中，并进行裸鼠体内抑瘤实验，研究3种载体以及不同治疗方法对erbBZ阳性肿瘤SKBr3的抑制作用，发现上述各种途径都可以使目的基因在体内表达，通过循环系统或自分泌／旁分泌的途径靶向识别erbBZ阳性细胞并内化，释放出有活性的分子实施促凋亡功能。其中，肌肉注射重组质粒用质体复合物可明显抑制肿瘤生长，抑制率为76．68％。并使治疗组裸鼠存活期较对照组裸鼠延长72刀9％。瘤体原位注射重组质协脂质体复合物也可抑制肿瘤生长，延长裸鼠存活期48．11％。 由于脂质体转移目的基因效率较低，需要反复给药。加之目前基因治疗更多采用逆转录病毒和重组腺病毒介导的基因转移途径，本文因而构建了逆转录病毒和重组腺病毒载体，制备出假病毒进行体内、外实验研究。 逆转录病毒是基因治疗实践中应用最早、最多、最成熟的基因转移方式，通过逆病毒介导基因修饰细胞（如T淋巴细胞）使之分泌靶向识别肿瘤表面抗原的效应分子（如免疫毒素等），特异性地杀伤肿瘤细胞，也是靶向基因治疗的一个重要途径。这种新型杀伤T淋巴细胞回输患者体内后，将在患者体内持续产生免疫毒素，通过体液循环至全身清除肿瘤细胞，特别对手术无法清除的微小病灶和转移灶有显著的清除和抑制作用。本文构建了重组逆病毒载体pLNCX－nununoc呷ase上并包装获得滴度较高的单克 3 第四军医大学博士学位论文隆包装细胞系，收集培养上清。体外实验显示病毒上清感染后的SKBr3、SKOV3细胞的生长受到抑制，出现明显的细胞凋亡，而Hela 细胞的生长则基本不受影响。应用逆病毒介导immunoc聊ase上基因修饰T淋巴细胞进行了体内、外抑瘤实验研究，发现该治疗方法可使裸鼠肿瘤生长速度