论文部分内容阅读
目的:检测肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)患者肝癌组织中癌-睾丸抗原NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)基因和蛋白水平的表达,为HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞过继免疫治疗肝癌进行可行性研究。建立高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株(HepG2)做为NY-ESO-1 TCR基因转导的T细胞在体外特异性免疫识别与杀伤实验的靶细胞。构建HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的T细胞受体(T cell receptor TCR)的真核表达载体,使其在HLA-A2基因型的健康人外周血T淋巴细胞中表达。方法: 120例HCC石蜡组织制成病理切片,应用免疫组织化学(immunohistochemistry IHC)两步法对HCC病人的癌组织、相应的癌旁非癌组织标本NY-ESO-1蛋白表达和分布情况进行检测。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对99例HCC病人的癌组织标本进行NY-ESO-1 mRNA检测。利用RT-PCR法从睾丸癌组织标本中获得NY-ESO-1全长基因,并克隆到载体pCDNA3.1上,获得质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1。用脂质体LipofectamineTM 2000将该真核表达载体转染人肝癌细胞系(HepG2)细胞,G418筛选后用RT-PCR及间接免疫荧光法检测NY-ESO-1在HepG2细胞中的表达,获得了高表达NY-ESO-1的HepG2细胞株。通过PCR扩增获得HLA-A2限制性NY-ESO-1TCR基因,并克隆到载体pCDNA3.1上,获得质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1 TCR。将质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1 TCR单酶切成为线性模板,体外转录为mRNA,Amaxa Nucleofection电转仪将其导入人外周血单个核淋巴细胞,用FITC标记的anti-TCR Vβ13.1对上述细胞进行染色,流式细胞术检测电转后T细胞的TCR基因转导效率。结果:(1)NY-ESO-1蛋白在癌旁组织中无表达,在120例肝癌组织中的阳性率为27.5%(33/120)。阳性部位大部分位于细胞浆,少量位于细胞核。NY-ESO-1 mRNA在99例肝癌组织中的阳性率为46.5%(46/99)。(2)用限制性内切酶酶切及PCR法检测真核表达载体PCDNA3.1/NY-ESO-1及PCDNA3.1/ESOTCR,结果显示两个载体均构建成功。经DNA序列分析,结果显示,在克隆中,各碱基均按照预期的顺序正确地组装成全长的目的DNA编码序列,没有发生碱基的重复和缺失现象。(3)获得了高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株(HepG2),RT-PCR、间接免疫荧光检测表明肝癌细胞系(HepG2)细胞经质粒PCDNA3.1/NY-ESO-1转染和G418筛选后稳定的高表达NY-ESO-1基因和蛋白,NY-ESO-1蛋白在细胞浆和核中均有表达。(4)真核表达载体PCDNA3.1/ESO TCR在体外转录的mRNA经RNA电泳和RT-PCR鉴定表明其为目的片段。HLA-A2+基因型健康人外周血PBMC在体外经IL-2、抗CD3抗体诱导5天,再ESO TCR mRNA电转24h后流式细胞术检测:CD3表达上调,CD8+T细胞TCR阳性表达细胞为:22.62%,CD4+T细胞TCR阳性表达细胞为:1.86%。结论:(1)NY-ESO-1 mRNA和蛋白在肝癌组织中高特异性表达,以其为靶标进行HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞过继免疫治疗肝癌的研究具有可行性。(2)建立了高表达NY-ESO-1抗原的肝癌细胞株(HepG2),使其成为NY-ESO-1 TCR基因转导的T细胞在体外特异性免疫识别与杀伤实验的靶细胞。(3)用RNA电转的方法使HLA-A2+基因型健康人外周血T细胞表面表达了NY-ESO-1 TCR,为下一步检测转导后T淋巴细胞的功能以及HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特异的TCR基因转导的人外周血T淋巴细胞在体外特异性识别和杀伤肝癌细胞的研究奠定了基础。