瑞香狼毒中细胞毒性物质分离鉴定

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瑞香狼毒(Stellera chamejasme L.)为瑞香科(Thymelaeaeeae)狼毒属(Stellera)植物,广泛分布于我国华北、西北、西南等地,在我国北方退化草地的局部区域已经形成优势种群或正在逐渐取代原有优势种的地位,极大的降低了草场的产量和质量,成为严重影响畜牧业发展的重要毒害草之一。研究表明,瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和杀虫等多种功能,且资源丰富,利用率低,所以瑞香狼毒具有巨大的研究和潜在的经济价值。瑞香狼毒成分复杂,具有活性的成分很多,但因其全株有毒,且主要毒性物质和引起人畜中毒的机理并不明确,因此大大限制了其进一步的开发利用。本文以瑞香狼毒为材料,重点对其毒性物质进行了提取、分离、纯化以及结构鉴定,以明确瑞香狼毒引起人畜中毒的主要物质,为其进一步开发利用打下基础。本文通过水、乙醇和石油醚3种试剂分别对瑞香狼毒的根、茎叶、花3个部位进行萃取,取9种粗提物浸膏进行MTT细胞毒性实验,对其细胞抑制率进行分析。结果表明:在48小时达到最大抑制率时,瑞香狼毒根石油醚萃取部位毒性最强,在0.2mg/ml剂量时,对人胚肾293A细胞和肝癌SMMC-7721细胞的抑制率分别达到46.978%和47.442%。因此,选取瑞香狼毒根石油醚萃取部位进一步分离纯化。对瑞香狼毒根石油醚萃取部位以石油醚:乙酸乙酯比例10:0至0:10为洗脱剂进行硅胶柱层析分离和纯化。并通过薄层层析和高效液相色谱对各组分进行检测。结果表明,在洗脱剂石油醚:乙酸乙酯比例为8:2、6:4和5:5时可洗脱得到某些成分。进一步对3组洗脱组分进行MTT细胞毒性试验,结果表明,在48小时达到最高细胞抑制率时,洗脱剂比例为6:4时的洗脱组分细胞毒性最强,这可能和其中含有毒性成分较多有关。在0.2mg/ml时,对人胚肾293A细胞和肝癌SMMC-7721细胞的抑制率分别达到38.850%和37.374%。但其活性和石油醚粗提物相比略有下降。对6:4洗脱组分进行进一步分离纯化,得到白色粉末状物质A和黄色油状混合物B。对白色粉末状物质A进行质谱数据和核磁共振氢谱、碳谱和二维核磁共振谱等数据检测,分析得到白色粉末状物质A为萜类化合物,具体化合物结构正在检测中。利用气相色谱-质谱联用技术对黄色油状物B进行分析,检测得到17种物质,其中γ-谷甾醇、2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene,2,6,10,15,19,23-h、和(Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienal为首次在瑞香狼毒中发现。并且其中化合物16未能找到对应质谱数据,因此化合物16未知。通过MTT细胞毒性实验数据可知,和柱层析洗脱物相比,黄色油状混合物B细胞毒性减弱,对细胞几乎无抑制作用;白色粉末A细胞毒性明显增强,且在前48小时内几乎不发挥抑制作用,但在第48-96小时中,细胞抑制活性与作用时间和剂量呈正相关。96小时,0.2mg/ml剂量时,对人胚肾293A细胞和肝癌SMMC-7721细胞的抑制率分别达到24.259%和56.694%。由数据可初步判断,化合物A为瑞香狼毒主要细胞毒性物质。
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