新基因Gsdma3对小鼠毛囊周期及Wnt/β-catenin信号通路作用的研究

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研究背景:毛囊是皮肤的重要附属器官,由多种类型细胞组成。出生后,小鼠毛囊经历周期性的生长(anagen)、退化(catagen)及静止(telogen)三个阶段的不断重复。在经历一段时期的生长后,小鼠毛囊进入退化期,此时毛球部细胞开始凋亡,逐渐形成上皮细胞索,DP被逐渐拉向表皮。当上皮细胞索彻底消失后,DP位于靠近Bulge的位置,毛囊退化停止,进入静止期。在经历一段时间的休息之后,毛囊感受到外界信号刺激,位于次级毛芽处的细胞最先开始增殖,触发新一轮的毛囊发育,之后bulge处的毛囊干细胞开始增殖,并向下迁移形成快速增殖细胞,毛囊开始下一轮周期循环。毛囊周期异常往往导致严重的毛囊疾病,如斑秃,雄激素性脱发,老年性脱发及产后脱发等,给患者身心带来巨大伤害,并且目前的治疗方式尚不理想,因此对毛囊周期调控的研究有助于为临床治疗脱发提供参考。多种信号通路参与毛囊周期循环的调控,其中最重要的是Wnt/β-catenin信号通路。目前已经发现了19个Wnt家族成员,根据胞内传播路径的不同分为经典Wnt信号通路(即Wnt/β-catenin信号通路)及非经典Wnt信号通路。其中Wnt/β-catenin信号通路作用于毛囊细胞的增殖及分化,参与毛囊形态发生及毛囊周期循环,因此一直受到毛囊研究者的关注。目前有关毛囊周期调控的报道多集中于生长期向退化期转变及静止期向生长期转变两方面,而退化期向静止期转变这方面的研究很少。Gasdermin A3(Gsdma3)基因隶属于Gasdermin基因家族,特异性的表达于小鼠表皮及毛囊角质形成细胞。我们前期研究发现,Gsdma3基因突变后小鼠毛囊周期出现异常,同时,Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin的表达量升高,提示Gsdma3基因对毛囊周期有调控作用,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的作用相关。研究目的:本课题拟通过分析Gsdma3基因在突变及过表达的情况下,对小鼠毛囊周期进程的作用及对Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的影响,证实Gsdma3基因是调节小鼠毛囊周期新因子,同时具有抑制Wnt/β-catenin信号通路的作用,以此加深对gsdma3基因功能的认识,丰富毛囊周期信号调控相关的理论,同时还可为临床相关疾病治疗的研究提供参考。方法:1.gsdma3基因突变对毛囊周期影响的研究通过h&e染色观察gsdma3基因突变鼠毛囊周期变化,并经过免疫荧光及碱性磷酸酶染色观察毛乳头(dp)位置变化;2.gsdma3基因回补对gsdma3基因突变鼠毛囊周期影响的研究3.gsdma3基因突变对毛囊第二轮生长期影响的研究通过外部观察及h&e染色检查gsdma3基因突变鼠第二轮毛囊生长期与野生型鼠是否一致;利用免疫荧光观察细胞增殖及毛囊干细胞变化,并通过免疫荧光及tunel实验统计细胞增殖及凋亡。4.gsdma3基因突变对wnt/β-catenin信号通路分子表达影响的研究(1)通过pcrarray及免疫荧光实验观察gsdma3基因突变鼠各时期wnt/β-catenin信号通路分子表达变化;(2)采用免疫荧光技术,观察gsdma3及β-catenin的表达及定位;观察wnt10b、β-catenin及lef1在毛囊周期各时间点的表达;(3)统计gsdma3基因突变鼠不同周期毛囊核阳性β-catenin细胞数。(4)退化期gsdma3基因突变鼠回补gsdma3及含有突变位点的gsdma3表达,观察毛wnt/β-catenin信号通路相关分子表达变化;(5)退化期野生型鼠过表达wnt10b,观察毛囊周期变化。5.gsdma3基因抑制wnt/β-catenin信号通路的研究(1)通过在野生型鼠中过表达gsdma3基因,用h&e、免疫荧光方法观察gsdma3基因对内源性wnt/β-catenin信号通路的影响;(2)在野生型鼠皮肤注射wnt10b腺病毒升高外源性wnt/β-catenin信号通路,同时注射gsdma3腺病毒,经h&e、免疫荧光检测gsdma3基因对外源性wnt/β-catenin信号通路及细胞增殖的影响;(3)培养jb6细胞,通过腺病毒过表达gsdma3及wnt10b,利用top/fop双荧光素酶报告基因及免疫荧光检测gsdma3基因对离体培养表皮细胞wnt/β-catenin信号通路及细胞增殖的影响。6.gsdma3基因调控wnt/β-catenin信号通路分子机制的研究(1)运用启动子报告质粒,对wnt/β-catenin信号通路核心分子wnt10b的转录调控进行分析;(2)利用抗gsdma3抗体进行chip实验,验证gsdma3是否为转录因子,以及寻找gsdma3调控靶基因;(3)经rt-pcr检测gsdma3基因突变鼠不同毛囊周期阶段维甲酸信号分子表达,通过维甲激动剂与gsdma3过表达质粒联合使用,观察gsdma3基因与维甲酸信号以及维甲酸信号与wnt10b基因表达的关系。结果与讨论:1.gsdma3基因突变引起毛囊静止期缺失(1)gsdma3基因突变鼠毛囊周期缺少静止期,在毛囊周期循环中gsdma3基因突变鼠一直保留上皮细胞索结构,使dp始终远离bulge;2.gsdma3基因回补后gsdma3基因突变鼠毛囊进入静止期。3.gsdma3基因突变不影响毛囊第二轮生长期进入gsdma3基因突变鼠进入第二轮毛囊生长期时间与野生型鼠相同;退化期毛囊增殖增加,凋亡减少;在退化期末,gsdma3基因突变鼠退化上皮细胞索细胞增殖强烈;gsdma3基因突变鼠不存在次级毛芽结构,但退化上皮细胞索下方细胞在第二轮生长期转换为次级毛芽结构,弥补了这一不足。4.wnt/β-catenin信号通路分子在gsdma3基因突变鼠背部皮肤中表达上调(1)gsdma3基因突变鼠各时期wnt/β-catenin信号通路分子表达升高;(2)退化期毛囊存在gsdma3及β-catenin的表达及定位;wnt10b、β-catenin及lef1在gsdma3基因突变鼠表达升高;(3)gsdma3基因突变鼠不同周期毛囊核阳性β-catenin细胞数增多;(4)回补gsdma3基因(而不是含有突变位点的gsdma3基因)导致退化期gsdma3基因突变鼠wnt/β-catenin信号通路活性下降;(5)野生型鼠过表达wnt10b,引起退化期延长。5.gsdma3基因对wnt/β-catenin信号通路有抑制作用(1)通过野生型鼠过表达gsdma3基因,引起内源性wnt/β-catenin信号通路分子表达降低,同时抑制了细胞增殖;(2)在野生型鼠过表达gsdma3基因,导致外源性wnt/β-catenin信号通路分子表达降低及细胞增殖减少。(3)过表达gsdma3基因抑制离体培养jb6细胞的top/fop报告基因活性,并且抑制经wnt10b腺病毒升高的wnt10b、β-catenin及lef1的表达及细胞增殖。6.Gsdma3基因可能通过升高维甲酸信号抑制wnt10b基因表达(1)Gsdma3基因不能直接抑制wnt10b的启动子活性;(2)Ch IP实验发现Gsdma3不是转录因子,因此Gsdma3基因可能通过间接途径调控wnt10b分子表达;(3)Gsdma3基因突变鼠背部皮肤维甲酸信号分子表达下降,Gsdma3基因可以通过激活维甲酸信号抑制wnt10b基因表达。结论:本研究首次发现Gsdma3基因突变会引起毛囊退化期向静止期的转变受阻、毛囊退化期延长,但不影响下一生长期到来,因此导致静止期缺失。而Wnt/β-catenin信号通路在调控这一过程中起重要作用。Gsdma3基因具有抑制Wnt/β-catenin信号通路的能力,并且可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路影响毛囊周期转换。Gsdma3基因对Wnt/β-catenin信号通路的抑制以维甲酸信号为中间媒介,Gsdma3基因可能通过升高维甲酸信号抑制wnt10b基因表达。本研究结果丰富了毛囊周期循环的调控理论,可以为临床相关研究提供理论依据。
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