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职业性六价铬[Cr(Ⅵ)]暴露主要来源于铬酸盐生产、电镀、铬铁生产和不锈钢焊接相关行业。Cr(Ⅵ)对人体危害严重,被IARC列为人类Ⅰ类致癌物,可诱导肺癌、鼻咽癌的发生。研究已显示Cr(Ⅵ)诱导人类皮肤细胞毒性、染色体畸变、DNA双链断裂等。叶酸在人体生化过程中,参与一碳单位的转移,为DNA甲基化提供甲基,在细胞内可以维持基因组的稳定,在合成、维持、修补DNA过程中发挥重要作用。本研究目的主要探讨Cr(Ⅵ)对HaCaT细胞损伤以及叶酸对Cr(Ⅵ)诱导HaCaT细胞损伤的作用,为进一步研究叶酸对Cr(Ⅵ)职业性接触人群的防护作用提供理论依据。研究内容包括:(1)MTT法检测不同浓度Cr(Ⅵ)及不同浓度叶酸对HaCaT细胞生存率的影响,获得IC50,并选取合适染毒浓度进行下一步实验。(2)SCGE/彗星实验检测Cr(Ⅵ)对HaCaT细胞DNA损伤情况,以及叶酸对Cr(Ⅵ)染毒HaCaT细胞DNA损伤的影响,采用尾长、尾矩、尾部DNA%评价DNA受损程度。(3)5-mC免疫荧光法检测不同剂量Cr(Ⅵ)作用于HaCaT细胞后,细胞内DNA甲基化水平的改变及叶酸在Cr(Ⅵ)所致的细胞DNA甲基化水平变化上的作用。(4)采用RT-PCR、蛋白免疫印迹法分别检测Cr(Ⅵ)作用于HaCaT细胞后细胞内hMLH1基因mRNA和hMLH1蛋白的表达水平变化以及叶酸对Cr(Ⅵ)致HaCaT细胞hMLH1基因和蛋白表达的影响作用。研究结果如下:(1)Cr(Ⅵ)染毒浓度升高,细胞生存率下降。当Cr(Ⅵ)染毒浓度为10.00μM及以上时,细胞生存率与对照组差异有统计学意义(P<0.05),IC 50为15.88μM。2.5-320.0n M的叶酸对细胞生存率无影响(P>0.05)。(2)非参数检验结果显示对照组与不同浓度Cr(Ⅵ)染毒组的DNA损伤指标(尾长、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩)差异有统计学意义(P<0.05);Cr(Ⅵ)浓度为10.00、20.00、40.00、80.00μM时,尾长、尾部DNA%、尾矩均比对照组高(P<0.05)。叶酸预处理组与正常对照组、Cr(Ⅵ)单独染毒组多组间各指标平均水平差异有统计学意义(P<0.05),叶酸浓度为320.0 n M时,尾长、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman相关分析结果显示,Cr(Ⅵ)剂量与尾长、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩分别呈正相关(r=0.915,P<0.01;r=0.846,P<0.01;r=0.879,P<0.01;r=0.869,P<0.01);叶酸剂量与尾长、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩分别呈负相关(r=-0.797,P<0.01;r=-0.740,P<0.01;r=-0.783,P<0.01;r=-0.751,P<0.01)。(3)方差分析结果显示各浓度Cr(Ⅵ)染毒组和对照组多组间平均光密度差异有统计学意义(F=11.367,P<0.01),LSD两组间比较结果显示Cr(Ⅵ)浓度为5.00μM以上时,平均光密度较对照组低(P<0.05)。经不同浓度叶酸(20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 n M)预处理的细胞,各浓度叶酸组与对照组、单独染毒组组间光密度差异有统计学意义(F=9.928,P<0.01),当叶酸预处理浓度为160.0 n M、320.0 n M时平均光密度比Cr(Ⅵ)单独染毒组高(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示Cr(Ⅵ)剂量与细胞平均光密度值呈负相关(r=-0.633,P<0.01);叶酸剂量与HaCaT细胞的平均光密度呈正相关(r=0.865,P<0.01)。(4)χ2检验结果显示Cr(Ⅵ)浓度为5.00μM及以上时,hMLH1基因表达水平较对照组低(P<0.01),在Cr(Ⅵ)浓度为10.00μM以上时,mRNA的表达率低于50%。Cr(Ⅵ)在中高浓度(10.00、20.00、40.00、80.00μM)时,hMLH1蛋白表达水平较对照组低(P<0.01)。χ2检验叶酸预处理组的细胞hMLH1 mRNA水平与对照组差异有统计学意义(P<0.01)。叶酸浓度为160.0 n M与320.0 n M时,mRNA表达水平比Cr(Ⅵ)单独染毒组高。叶酸较高浓度(80.0 n M、160.0 n M)时,蛋白表达水平较对照组和Cr(Ⅵ)单独染毒组高(P<0.01)。