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背景:成年心肌细胞有限的自我更新能力,不足以弥补损伤引起的心肌细胞丢失,是多种心血管疾病导致心力衰竭的重要原因。促进内源性心肌细胞增殖,以补充丢失的心肌细胞,从而挽救心功能,被认为可能是治疗心力衰竭患者最有前景的手段。小鼠心脏在出生后拥有短暂的损伤后再生能力,但这种再生潜能在出生后7天消失。出生后伴随再生能力丢失,心肌细胞代谢模式发生转变,糖酵解下调,有氧代谢上调,这被认为是引起心肌细胞细胞周期停滞的重要原因。调控心肌细胞代谢,已成为调节心肌细胞增殖的重要手段之一。近来研究表明,FOXK1及FOXK2可通过调控多种代谢相关酶促进细胞糖酵解,抑制丙酮酸在线粒体中的氧化。FOXK1及FOXK2是否能调控心肌细胞代谢及心肌细胞增殖,继而影响心脏再生是值得探讨的方向。目的:探讨FOXK1及FOXK2在心肌细胞代谢和增殖,及心脏再生中的作用与机制。方法与结果:一、FOXK1/K2促进心肌细胞糖酵解并抑制氧化磷酸化。使用糖酵解抑制剂2-DG抑制心肌细胞的糖酵解,结果表明,抑制心肌细胞糖酵解后,心肌细胞增殖被抑制,同时引起FOXK1及FOXK2 m RNA及蛋白均明显表达增高。干预心肌细胞FOXK1或FOXK2表达后行Seahorse细胞能量代谢分析仪测试,结果表明,敲低心肌细胞FOXK1或FOXK2表达后引起心肌细胞糖酵解降低,氧化磷酸化升高;过表达心肌细胞FOXK1或FOXK2促进心肌细胞糖酵解,抑制氧化磷酸化。二、FOXK1/K2在心肌细胞增殖及心脏再生中发挥重要作用。体外细胞实验结果表明,敲低心肌细胞FOXK1或FOXK2的表达,心肌细胞增殖被抑制,心肌细胞过表达FOXK1或FOXK2后引起心肌细胞增殖增加。给出生后1天（P1）小鼠注射腺相关病毒（AAV-9）使心肌细胞特异性过表达FOXK1或FOXK2可促进P14心肌细胞增殖,并使心肌细胞数量增加,单核二倍体的心肌细胞比例增加。接下来,分别构建了心肌细胞特异性敲除FOXK1小鼠及FOXK2全身敲除小鼠,并在出生后1天构建心脏损伤模型,心肌梗死。结果表明,心肌细胞特异性敲除FOXK1或全身敲除FOXK2后,P1小鼠心梗后P28不能实现心脏再生,P28心功能明显差于对照组,且P6心肌细胞增殖明显低于对照组。进一步地,成年野生型小鼠心梗后给予AAV-9注射,使心肌细胞特异性过表达FOXK1或FOXK2。术后56天结果表明,心肌细胞特异性过表达FOXK1或FOXK2后,相较于对照组,小鼠心梗后心功能明显恢复,心梗面积明显减小;并且在心梗后14天,心肌细胞特异性过表达FOXK1或FOXK2后明显促进成年小鼠心梗后心肌细胞增殖。三、探索FOXK1/K2调控心肌细胞代谢及增殖的机制3.1 Hif-1α调控FOXK1/K2诱导的心肌细胞代谢重编程为了筛选FOXK1及FOXK2调控的下游基因,我们通过CUT＆Tag后测序来分析FOXK1或FOXK2直接结合的序列。结果提示,FOXK1及FOXK2均可与Hif-1α启动子区域结合,并且通过Chip后q RT-PCR（Chip-q RT-PCR）得到进一步证实。q RT-PCR及WB结果表明,FOXK1及FOXK2可调控Hif-1αm RNA及蛋白的表达。进一步地,体外心肌细胞过表达FOXK1或FOXK2的同时利用si RNA敲低Hif-1α的表达后分别进行代谢分析并检测增殖变化。结果表明,敲低Hif-1α后可以减弱心肌细胞过表达FOXK1或FOXK2引起的糖酵解升高及氧化磷酸化减小,同时也可抑制心肌细胞过表达FOXK1或FOXK2引起的增殖增加。上述结果表明FOXK1及FOXK2均可通过调控Hif-1α的表达调控心肌细胞代谢。3.2 DNA损伤应答通路与FOXK1/K2调控的心肌细胞增殖有关使用ROS检测试剂盒检测心肌细胞ROS产生,发现体外分离心肌细胞后敲低FOXK1或FOXK2表达引起心肌细胞ROS产生增加。在心肌细胞特异性敲除FOXK1或全身敲除FOXK2基因工程小鼠中,P1心梗后P6心肌细胞ROS产生也明显增多,并且DNA氧化损伤明显增加,DNA损伤应答通路被激活。进一步通过WB发现,体外敲低心肌细胞FOXK1或FOXK2表达后,细胞周期抑制激酶Wee1蛋白表达升高。上述结果表明FOXK1及FOXK2调控的心肌细胞代谢通过影响DNA损伤应答通路进一步影响心肌细胞增殖。3.3 FOXK1直接调控Ccnb1促进心肌细胞增殖进一步分析CUT＆Tag后测序数据发现,FOXK1可与Ccnb1启动子区域结合,并且通过Chip-q RT-PCR得到进一步证实。通过q RT-PCR及WB发现FOXK1可调控Ccnb1的表达。进一步在体外分离心肌细胞,心肌细胞过表达FOXK1的同时si RNA敲低Ccnb1的表达后检测心肌细胞增殖的变化,发现过表达FOXK1引起的心肌细胞增殖增加被敲低Ccnb1表达抑制。上述结果表明FOXK1可以通过直接调控Ccnb1的表达来影响心肌细胞增殖。3.4 FOXK2直接调控Cdk1促进心肌细胞增殖深入分析CUT＆Tag后测序数据发现,FOXK2可与Cdk1启动子区域结合,并且通过Chip-q RT-PCR得到进一步证实。通过q RT-PCR及WB发现FOXK2可调控Cdk1的表达。进一步地,通过在体外分离心肌细胞,心肌细胞过表达FOXK2的同时si RNA敲低Cdk1的表达后检测心肌细胞增殖,发现过表达FOXK2引起的心肌细胞增殖增加被敲低Cdk1表达抑制。上述结果表明FOXK2可以通过直接调控Cdk1的表达来调控心肌细胞增殖。结论:通过以上实验可以得出如下结论,我们证明了FOXK1及FOXK2促进心肌细胞糖酵解,抑制氧化磷酸化,抑制DNA损伤应答通路,促进心肌细胞增殖和成年小鼠心梗后心脏再生。另一方面,FOXK1可以通过直接结合Ccnb1的启动子促进其表达进而促进心肌细胞增殖;FOXK2可以通过直接结合Cdk1启动子促进其表达进而促进心肌细胞增殖。本研究提示FOXK1及FOXK2有潜力成为促进心肌梗死后心脏再生及治疗心力衰竭的新靶点。