目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一类主要累及运动神经元的进展性神经变性病,目前尚无有效的治疗方法。本研究拟通过不同浓度的健脾益肺方治疗ALS的动物模型hSODl-G93A转基因小鼠,通过检测模型小鼠的运动功能和脊髓前角运动神经元的存活情况来评价健脾益肺方的疗效,检测脊髓的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性来评价健脾益肺方的抗氧化自由基作用。为中药组方治疗ALS动物模型的疗效及作用机制提供初步的实验依据。方法：一、试剂和设备(一)健脾益肺方组成：黄芪9g,党参4.5g,白术4.5g,茯苓1g,麦冬3g,陈皮0.5g,法夏0.5g,杏仁1g,射干1g,石菖蒲0.5g,白附子0.5g,僵蚕0.5g,制马钱子0.1g,炙甘草2g。全部购买无糖颗粒剂型,批号：YPA2L0002,购自江阴天江药业有限公司。(二)MDA.GSH.SOD和GSH-Px的检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；焦油紫购自Sigma-Aldrich公司,其他普通试剂为国产分析纯。二、实验动物及分组(一)hSODl-G93A转基因小鼠购买自南京大学-南京生物医药研究院。(二)动物分组：应用8周龄的hSODl-G93A转基因小鼠共24只,按数字编号随机分为四组,每组6只。(1)生理盐水组(2)低浓度健脾益肺方组(2.86g／Kg)(3)中浓度健脾益肺方组(5.72g／Kg)(4)高浓度健脾益肺方组(11.44g／Kg),选同窝8周的普通野生型小鼠共6只为正常对照组,灌注生理盐水。观察小鼠的运动功能及生存期,终末期时分别取各组实验鼠各3只,进行脊髓前角运动神经元的尼氏染色,另每组3只进行抗氧化自由基实验。三、具体实验步骤(一)健脾益肺组方治疗后模型小鼠的体重变化每日实验前采用电子秤称量模型小鼠的体重,并做好记录。(二)健脾益肺组方治疗后模型小鼠发病时间、生存期及运动功能的评估1.发病时间(每日评定)采用Weydt 4分法进行评定：4分：没有运动功能异常；3分：悬尾时出现后肢颤抖；2分：步态异常；1分：至少1个后肢出现拖曳；0分：将鼠翻身成仰卧位30s内无法翻回俯卧位。发病评价：回顾性分析(超过2周),以Weydt＜4分的初始时间作为发病开始。2.生存期死亡时间：将鼠翻身为仰卧位30s内无法翻回俯卧位即Weydt为0分,登记为死亡。3.运动功能(1)悬尾实验：悬提鼠尾,观测后肢的伸张及其曲腰情况,并予评分。2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。(2)牵引实验：将小鼠放于30公分长的铁丝上,小鼠5分钟内掉落的次数(小鼠掉落后,立刻将其放置铁丝上继续实验)。(3)跑台实验：将小鼠放在疲劳转棒仪上,以转速16圈／分钟连续5分钟,登记每组小鼠的平均掉棒次数(小鼠掉棒后,立即将其放置回疲劳转棒仪上继续实验)。(三)健脾益肺组方治疗后的病理改变应用4%的多聚甲醛经心脏灌注,后固定24小时,蔗糖梯度脱水,用OCT包埋,取脊髓的腰段进行冰冻切片(切片厚度20μm),每隔3片取1片。应用焦油紫进行尼氏染色。前角运动神经元的计数标准：具有清晰可辨的尼氏结构,清晰的细胞核和核仁,胞体较大的多角细胞。(四)健脾益肺组方治疗机制的探讨抗氧化自由基：硫代巴比妥酸法检测MDA的含量；亚硝酸盐法测定SOD的活性；二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH的含量；二硝基苯甲酸法测定GSH-Px的活性,按照试剂盒说明书操作。结果：1.体重的变化8周龄模型小鼠开始进行体重测定,第8-12周各组间的体重无显著性差异,至第12周开始,生理盐水组模型小鼠体重开始减轻,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重仍缓慢增加；第13周开始,低浓度、中浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重也开始下降,而高浓度组模型小鼠体重仍在缓慢增加；约15周开始,高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重开始下降,同生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重下降趋势较慢,且呈浓度正相关性。低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异不具有统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。2.对发病时间和生存期的影响生理盐水组的模型小鼠在(101.5±3.45)天出现临床症状,即Weydt 4分法,评分<4分时(为发病时间),模型小鼠在病程中会出现后肢无力,悬尾时后肢震颤、后伸乏力的表现,至终末期时双侧后肢呈牵直样强直、背部屈曲,终因饮食艰难、呼吸无力而死亡,平均存活时间为(133.2±2.32)天。低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的发病时间分别为(103.3±2.16)天、(109.5±1.87)天、(112±3.03)天,低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异无统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较差异具有统计学意义。低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的生存期分别为(134.3±1.86)天, (140.2±2.32)天,(147.8±1.17)天,低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异无统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠较生理盐水组模型小鼠的生存时间延长,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。3.运动功能：牵引实验：同一时期不同浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的坠落次数并不一样,健脾益肺方治疗组的模型小鼠较生理盐水组模型小鼠明显耐受性好,且呈浓度正相关性,低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异无统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方组模型小鼠同生理盐水组模型小鼠比较差异具有显著的统计学意义(p＜0.01)跑台实验：同期中,健脾益肺方治疗组的模型小鼠较生理盐水组模型小鼠坠落明显减少,同样呈浓度正相关性：低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠同生理盐水组模型小鼠比较差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。4.脊髓前角运动神经元的计数随着鼠龄的增长,模型小鼠的腰段脊髓前角病变的神经元会逐步出现尼氏体不清、变性,核固缩,细胞体积减小,细胞萎缩,数量减少,整个脊髓前角外形萎缩,病变随时间延长而进行性加重。终末期取生理盐水组、阴性对照组、低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组病理切片尼氏染色。生理盐水治疗组运动神经元计数为(3.86±1.215)个／视野,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方组分别为(4.00±0.816)个/视野, (4.57±0.976)个/视野, (7.57±0.976)个/视野,阴性对照组运动神经元计数为(9.82±0.216)个/视野。低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,无统计学意义；中浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有统计学意义(p<0.05)；高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；阴性对照组小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)5.谷胱甘肽(GSH)的含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GH-Px)的活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)的含量生理盐水组模型小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最低,MDA值最高；阴性对照组小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最高,MDA值最低。健脾益肺方组模型小鼠的GSH、GSH-PX、 SOD值随着浓度的增高而增高,MDA值随着浓度增高而减低。低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,不具有统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠相比,差异具有显著的统计学意义(p＜0.01)；阴性对照组小鼠与生理盐水组模型小鼠相比,差异具有显著的统计学意义(p<0.01)。结论：中浓度、高浓度健脾益肺方延缓hSODl-G93A转基因小鼠的体重下降,延缓hSODl-G93A转基因小鼠的发病时间,增加hSODl-G93A转基因小鼠存活天数,改善hSODl-G93A转基因小鼠的运动功能,可能是通过中浓度、高浓度健脾益肺方提高抗氧化能力,降低氧化自由基损伤,达到了保护神经细胞目的,延缓了神经细胞的凋亡过程,从而使疾病的进展变得缓慢。本研究采用ALS的经典模型hSODl-G93A转基因小鼠进行中药的疗效及机制研究,为中药治疗ALS提供了动物模型研究依据。应用不同浓度的健脾益肺方治疗ALS,对健脾益肺方的作用机制进行了初步探讨,为健脾益肺方治疗ALS提供了初步的动物实验依据。