目的本实验旨在优化萝藦种子生物碱的提取工艺,分离纯化生物碱,并研究其对人肝癌SMMC-7721细胞的作用。为萝藦种子生物碱的研究发展提供实验依据。方法采用酸水提取法提取萝藦种子生物碱,以生物碱提取率为衡量标准。通过单因素实验,选择对生物碱提取率有较大影响的四个因素(盐酸水溶液p H、料液比、提取温度、提取时间)的合适范围,在单因素实验的基础上,通过正交设计优化萝藦种子生物碱提取工艺,确定最佳提取条件。通过硅胶柱层析分离法,对提取的粗生物碱进行分离纯化,采用质谱和核磁共振波谱法(NMR,Nuclear Magnetic Resonance)对分离纯化后的生物碱进行分子量和结构鉴定。通过MTT法、流式细胞术、Western blot、划痕实验研究分离出的N-Nornuciferine对人肝癌SMMC-7721细胞活力、凋亡和抑制迁移的作用。结果通过单因素实验和正交实验进行提取工艺优化,确定萝藦种子生物碱的最佳提取条件为:盐酸水溶液p H为2、料液比1:20(g/m L)、提取时间2.0 h、提取温度70℃,在此工艺条件下萝藦种子生物碱的提取率为2.91%。根据上述条件所提取出的生物碱为粗生物碱,需进一步分离纯化。经硅胶柱分离纯化得到一种单体生物碱,经质谱和核磁共振波谱法鉴定生物碱是N-Nornuciferine,分子量为281.3。MTT实验表明N-Nornuciferine可抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。通过流式细胞仪使用AV-PI双染法进行实验,结果表明,与Control组相比,N-Nornuciferine可诱导SMMC-7721细胞明显的凋亡,并呈现出一定的浓度依赖性。采用JC-1试剂盒结合流式细胞仪进行检测,结果证实N-Nornuciferine可明显导致SMMC-7721细胞内线粒体膜电位降低。Western Blot实验结果显示Bcl-2蛋白表达量下降,BAX和Cleaved PARP蛋白表达量上升,表明N-Nornuciferine诱导SMMC-7721细胞凋亡。划痕实验和Western Blot证实了N-Nornuciferine可减少SMMC-7721细胞的迁移。结论通过单因素实验和正交实验优化后的提取工艺使萝藦种子生物碱提取率提高。采用硅胶柱对粗生物碱分离纯化得到一种单体生物碱N-Nornuciferine,分子量为281.3。细胞实验表明,N-Nornuciferine具有抑制SMMC-7721细胞增殖、诱导SMMC-7721细胞凋亡及减少SMMC-7721细胞迁移的作用。