核酸滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式而建立的一种恒温核酸扩增技术，以其高效和简单的特点受到了广泛的关注，不仅在生命科学各个研究领域发挥着关键作用，并且在农业、医疗、取证、环境监测等各个方面都被广泛应用。在第一代RCA反应中，当有环状DNA模板、引物和聚合酶时，通过DNA聚合酶的作用，以环形DNA为模板进行复制，引物被延伸并最终形成一条与环状DNA模板互补的具有重复序列的线状DNA单链，因此该体系也常被称为线性滚环扩增技术（Linear RCA，LRCA）。尽管LRCA的研究已经比较成熟，但是仍存在灵敏度低，特异性弱等诸多问题。近年来，随着各种其他新型核酸扩增技术的不断涌现，为RCA技术的进一步发展提供了良好的契机。综合上述背景，在本工作中，我们针对RCA进行了深入的研究，在原有LRCA的基础上，通过精心的设计，发展了具备更优性能的新型恒温核酸扩增技术，从而为核酸的高灵敏检测以及新型生物传感器的构建等提供了条件。第一章新型网状滚环扩增技术的研究在本章中，我们开发了一种新型核酸滚环扩增技术。该技术在第一代线性滚环扩增（LRCA，一维扩增）技术和第二代超分支滚环扩增技术（HyperbranchedRCA，HRCA，二维扩增）的基础上，引入了一种特殊的核酸内切酶，即切刻内切酶，从而实现了在不需要额外时间和操作的前提下，核酸扩增效率的进一步大幅提升，并由此发展出了第三代滚环扩增技术——网状滚环扩增技术（NetlikeRCA，NRCA，三维扩增）。本研究采用传统的琼脂糖凝胶电泳手段对NRCA的反应条件进行了优化，使用荧光定量PCR对不同浓度靶标DNA的扩增反应进行了实时监测，并用原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）对NRCA反应的扩增产物进行了直观的表征。通过对LRCA, HRCA和NRCA的比较，结果表明第三代滚环扩增技术NRCA具有超高的扩增效率，可以实现靶标DNA的高灵敏检测，检测范围跨度达0.1fM至1μM，检测限为13aM。此外，AFM的直接观测结果表明，NRCA的扩增产物形态呈现密集且均一的网状结构，从而在实际中证实了这种高效的网状扩增方式。该工作首次实现了三维网状扩增及其直观的表征，与第一代LRCA和第二代HRCA相比，该技术一方面没有牺牲原有技术在操作性、使用成本、扩增所需时间等方面的优势，另一方面则在原有技术基础上进一步实现了信号放大，从而为低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件，其应用前景非常广阔。第二章基于滚环扩增和杂交连锁反应的双重信号放大策略研究在本章中，我们通过巧妙的设计将RCA与一种新近发展起来的核酸放大技术－杂交连锁反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）进行了有机的组装，从而实现了基于滚环扩增和杂交连锁反应（HCR@RCA）的双重信号放大策略。HCR是一种无需酶参与的反应，体系中仅由两个部分互补且具有茎环结构的寡聚核苷酸组成，当靶标DNA存在时，靶标DNA可以触发两个寡聚核苷酸的茎环结构一个接一个的相继打开，并通过互补杂交形成长的双链，通过引入合理的信号，从而可实现靶标DNA的信号放大分析。利用HCR这一特点，我们将其与RCA巧妙组合，通过RCA首先将靶标DNA进行扩增，扩增出的线性长链DNA中连续的靶标DNA片段可以分别触发相应规模的HCR过程，从而实现对RCA产物的进一步放大。本研究采用传统的琼脂糖凝胶电泳手段对HCR@RCA的反应条件进行了优化，使用荧光定量PCR对不同浓度靶标DNA的扩增反应进行了实时监测，并用AFM对反应的扩增产物进行了直观的表征。结果表明，该技术与传统RCA或HCR相比，扩增效率及检测灵敏度均获得了很大的提升。此外，这两个既相互独立又整合于一体的过程均具有一定的序列特异性，二者的有效互补有望进一步提升核酸分析的准确性。该体系采用两种独立的信号放大技术的整合，其设计思路为新型恒温核酸扩增技术的发展提供了良好的借鉴。