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乳腺的发育随着动物的生殖及泌乳周期经历生长、分化及退化等周期性变化,乳腺上皮细胞的增殖和凋亡贯穿于泌乳的整个过程。乳腺上皮细胞能合成和分泌乳蛋白,其数量及单个细胞的泌乳能力是决定奶牛产奶量的重要因素。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lnc RNAs)和micro RNA(mi RNAs)通过调控基因的表达,参与乳腺发育及泌乳过程。课题组前期对泌乳期和干奶期的奶牛乳腺组织RNA-Seq测序分析结果表明,TCONS-71659(命名为lnc RNA MPNCR,mammary proliferation-associated long noncoding RNA)泌乳期表达量显著高于干奶期,推测该lnc RNA参与奶牛的泌乳调控。因此,本研究以奶牛乳腺上皮细胞系(BMECs)为研究对象,首先通过MTT及Ed U试验,探究lnc RNA MPNCR对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖的影响,并通过RT-q PCR和Western Blot试验,对其可能作为内源性竞争RNA(ce RNA)参与奶牛乳腺上皮细胞的增殖调控机制进行了探究,获得的结果如下:1.为确定lnc RNA MPNCR在奶牛乳腺上皮细胞中的作用,分别向BMECs中转染pc DNA3.1(+)-lnc RNA MPNCR载体与pc DNA3.1(+)空载体。MTT试验结果显示,与对照组相比,过表达lnc RNA MPNCR显著抑制BMECs的细胞活力(P<0.01);Ed U结果表明,过表达lnc RNA MPNCR后,显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P<0.01)。2.为确定lnc RNA MPNCR影响奶牛乳腺上皮细胞增殖的调控机制,对lnc RNA MPNCR进行亚细胞定位,结果显示lnc RNA MPNCR在细胞核和细胞质中均有表达。生物信息学软件分析显示mi R-31与lnc RNA MPNCR之间存在结合位点,通过双荧光素酶试验及RT-q PCR探究lnc RNA MPNCR与mi R-31的相关性。双荧光素酶试验结果表明,与mi R-31 mimic-NC组相比,转染mi R-31 mimic组显著降低lnc RNA MPNCR的荧光活性比(海肾酶活/荧火虫酶活,R/F)(P<0.05)。RT-q PCR结果显示,在BMECs中转染pc DNA3.1(+)-lnc RNA MPNCR载体显著抑制mi R-31的表达(P<0.01)。且过表达mi R-31后,lnc RNA MPNCR的表达水平显著下降(P<0.01);抑制mi R-31的表达后,lnc RNA MPNCR表达量显著提高(P<0.05),表明lnc RNA MPNCR调控mi R-31的表达。3.为确定mi R-31的功能及靶基因,向BMECs中分别转染mi R-31 mimic(或mimic-NC)和mi R-31 inhibitor(或inhibitor-NC)。MTT结果表明,与对照组相比,过表达mi R-31显著提高了奶牛乳腺上皮细胞活力(P<0.01),抑制mi R-31的表达后显著抑制了细胞活力(P<0.05)。Ed U试验结果表明,mi R-31 mimic组显著促进了BMECs增殖(P<0.01),而mi R-31 inhibitor组显著抑制了细胞的增殖。双荧光素酶试验显示,mi R-31显著抑制CAMK2D 3’UTR的双荧光酶活比值(海肾酶活/萤火虫酶活,R/F)(P<0.01)。RT-q PCR及Western Blot结果显示,过表达mi R-31显著抑制CAMK2D的表达(P<0.01),而抑制mi R-31的表达后,CAMK2D的表达显著提高(P<0.05)。上述试验结果表明,CAMK2D是mi R-31的靶基因。4、为探究lnc RNA MPNCR对CAMK2D的调控作用,向BMECs中转染pc DNA3.1(+)-lnc RNA MPNCR载体与pc DNA3.1(+)空载体。RT-q PCR及Western Blot结果显示,过表达lnc RNA MPNCR显著提高了靶基因CAMK2D在m RNA及蛋白水平的表达量(P<0.01)。将pc DNA 3.1(+)-lnc RNA MPNCR和mi R-31 mimic共转染的功能回复试验进一步表明,lnc RNA MPNCR通过靶向结合mi R-31抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖(P<0.05)。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,lnc RNA MPNCR通过吸附抑制mi R-31的表达,进而调节mi R-31下游增殖相关靶基因CAMK2D的表达,即lnc RNA MPNCR作为mi R-31的ce RNA抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本研究以lnc RNA MPNCR为出发点,揭示了其在奶牛乳腺上皮细胞中的作用与机制,通过与其相关联的mi RNA及靶基因,探究三者的调控关系,为深入探究lnc RNA对奶牛乳腺上皮细胞的调控机理提供理论依据。