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目的:基于新发布的Illumina Nextseq2000平台,建立宏基因组测序方案。获得Illumina Nextseq2000的宏基因组测序特点,探讨其在呼吸道感染病原体识别中的应用价值。方法:1.在人健康咽拭子洗脱液及无病原的支气管肺泡灌洗液中加入4种梯度稀释的病原体（以金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性菌;副溶血性弧菌代表革兰氏阴性菌;白色念珠菌代表真菌;乙型流感病毒代表RNA病毒）,建立单病原及多病原模拟样本。通过对模拟样本进行宏基因组测序和荧光定量PCR检测,优化建库流程及核酸提取办法,建立Illumina Nextseq2000宏基因组测序方案,探讨Illumina Nextseq2000宏基因组测序的测序性能及特点。2.对2022年3月于华中科技大学协和深圳医院收集的2例发热门诊患者荧光定量PCR筛查阴性样本,采用RNA建库方式进行宏基因组测序,获得检测结果。验证基于Illumina Nextseq2000平台的宏基因组测序方案在上呼吸道未知病原体识别中的应用价值。3.将2022年1月至2022年11月期间于深圳市前海蛇口自贸区医院收集的55例肺炎病例样本,分为免疫抑制组和非免疫抑制组,采用DNA建库方式进行宏基因组测序。对比培养结果,进行统计学分析,验证基于Illumina Nextseq2000平台的宏基因组测序方案在下呼吸道DNA病原体识别中的应用价值。结果:1.多病原模拟样本宏基因组测序结果中,支气管肺泡灌洗液多病原模拟样本的人源检出序列数高于咽拭子洗脱液;20M测序数据量的病原体检出种类与50M相同,20M的病原体检出序列数占50M的6.87%～75.71%,平均占比为46.86%;DNA建库方式的人源检出序列数较RNA建库方式更高。2.不同浓度的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌稀释液中,QIAamp DNA Blood＆Tissue Kit（过滤法）提取DNA的Ct值低于其他两种方法（P＜0.05）。副溶血性弧菌10~4～10~5稀释液中,TIANLONG Cq Ex-DNA基因组核酸提取试剂盒（磁珠法）、QIAamp DNA Blood＆Tissue Kit（过滤法）、以及DNeasy Power Soil Pro Kit（研磨珠+过滤法）提取DNA的Ct值相同（P＞0.05）。3.单病原模拟样本病原体稀释倍数与荧光定量PCR的Ct值大致呈线性关系、荧光定量PCR的Ct值与经对数变换的宏基因组测序序列数大致呈反向线性关系、DNA病原体浓度与经对数变换的宏基因组测序序列数大致呈线性关系。Illumina Nextseq2000的宏基因组测序方案针对4种病原体的检出限均较荧光定量PCR更低。4.对57例呼吸道感染患者样本进行宏基因组测序结果发现:上呼吸道感染患者1,潜在病原为副流感嗜血杆菌、具核梭杆菌、口放线菌、洋葱伯克霍尔德菌复合体、罗尔斯顿氏菌、睾丸酮丛毛单胞菌。上呼吸道感染患者2,潜在病原为流感嗜血杆菌。55例肺炎患者的支气管肺泡灌洗液中共检出64种微生物,其中,革兰氏阳性菌14种,革兰氏阴性菌46种,真菌1种,支原体2种,DNA病毒1种。测序结果累计检出序列数前五及检出例数前四的微生物均为革兰氏阴性菌。5.对比肺炎患者支气管肺泡灌洗液的培养结果与宏基因组测序结果,进行统计学分析,结果显示,纹带棒状杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌两种微生物检出数的差异具有统计学意义（P＜0.05）,宏基因组测序的检出率高于培养的检出率。对比培养,宏基因组测序对肺炎克雷伯菌的灵敏度为81.82%,特异度为87.50%,符合率为85.71%,Kappa值为0.677。对免疫抑制组与非免疫抑制组支气管肺泡灌洗液的测序结果进行统计学分析,结果显示,嗜麦芽窄食单胞菌、纹带棒状杆菌、木糖氧化无色杆菌、粪产碱杆菌4种微生物检出数的差异具有统计学意义（P＜0.05）,免疫抑制组的检出率高于非免疫抑制组。结论:1.对比DNA的建库方式,采用RNA建库方式能去除部分r RNA,降低人源检出序列数,宏基因组测序时应根据样本特点和测序目的灵活选择建库方式。使用20M测序数据量的病原体检出种类与50M测序数据量相同,但20M与50M的检出序列比波动较大（6.87%～75.71%）,为了保证数据质量,应采用50M进行测序。2.TIANLONG Cq Ex-DNA提取试剂盒（磁珠法）、QIAamp DNA Blood＆Tissue Kit（过滤法）、DNeasy Power Soil Pro Kit（研磨珠+过滤法）,3种DNA提取试剂盒中,QIAamp DNA Blood＆Tissue Kit（过滤法）的DNA提取效率最高。3.Illumina Nextseq2000的宏基因组测序对4种模拟病原体的检出限较荧光定量PCR更低;经对数变换的宏基因组测序检出序列数、荧光定量PCR Ct值、DNA病原体浓度之间具有一定线性关系,提示宏基因组测序能在检测未知病原的基础上,辅助病原菌的载量判断。4.对比荧光定量PCR及培养结果,宏基因组测序具有较高的准确率和灵敏度。基于现有的Illumina Nextseq2000的宏基因组测序方案,能够应用于呼吸道未知病原样本识别可能的病原、发现患者的混合感染。