外源性添加Ghrelin对IBDV亚临床感染雏鸡法氏囊和盲肠扁桃体的影响

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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是造成养禽业严重经济损失的重要传染病之一。目前IBD的发生已由典型的“急性临床型”为主转变为以不典型的“亚临床型”为主,使IBD的隐匿性和危害性更强,防治该病变得愈发困难。消化道黏膜是IBDV入侵宿主的主要门户之一,禽类盲肠扁桃体(CT)是禽类肠道相关淋巴组织(GALT)的重要组成部分,是肠道病原感染最早发生反应的场所。因而探索禽类盲肠扁桃体在雏鸡IBDV感染时的变化是研究IBDV发生的重要方向。Ghrelin为一种肽类激素,参与多种生物学功能。实验室前期研究发现Ghrelin添加能减轻IBDV强毒株感染导致的雏鸡法氏囊损伤、缩短其修复进程,然而,在雏鸡亚临床感染中的作用尚不明晰。因此,本课题将雏鸡随机分为空白组(C组)、IBDV感染组(I组)、Ghrelin添加+IBDV感染组(G+I组),I组和G+I组雏鸡饲养至19日龄接种IBDV构建亚临床感染模型,且C组用生理盐水做相同处理。G+I组从17日龄开始雏鸡腹腔注射0.5 nmol/100g Ghrelin(0.01%冰醋酸溶液配制)至23日龄结束。且C组和I组用配制好的0.01%冰醋酸溶液做相同处理。本实验利用q RT-PCR、石蜡切片、HE染色和免疫组织化学染色、高通量测序的转录组分析等方法探索Ghrelin添加对雏鸡亚临床感染雏鸡法氏囊和盲肠扁桃体的作用,为临床能否通过Ghrelin添加减少雏鸡IBDV亚临床感染的发生提供理论依据。实验结果显示:1.Ghrelin添加对IBDV亚临床感染雏鸡体重和法氏囊的影响(1)PCR检测SPF鸡胚和SPF鸡增殖的病毒,在约216 bp处有一条清晰明亮的目的条带,表明IBDV感染成功。扩增的病毒接种京红商品型蛋鸡后,经PCR检测同样在约216 bp处有一条清晰明亮的目的条带,表明病毒接种成功。雏鸡临床症状不明显,但法氏囊萎缩,且在I组检测到IBDV VP3免疫阳性细胞的存在,说明雏鸡IBDV亚临床感染模型构建成功。(2)1 dpi和3 dpi时,G+I与I组相比,雏鸡体重增加,差异显著(P﹤0.05);(3)1 dpi时,G+I与I组相比,雏鸡法氏囊指数升高,差异显著(P﹤0.05);(4)与C组相比,1~5 dpi I组雏鸡法氏囊小滤泡占比增加,大滤泡占比减少。而G+I组与I组相比,雏鸡法氏囊大滤泡占比增加,小滤泡占比减少。2.Ghrelin添加对IBDV亚临床感染雏鸡盲肠扁桃体的影响(1)1~7 dpi,与对照组相比,I组雏鸡盲肠扁桃体固有层厚度不同程度增加,G+I组雏鸡盲肠扁桃体固有层厚度与I组相比降低,且3 dpi时差异显著(P﹤0.05)。(2)与C组相比,I组雏鸡盲肠扁桃体面积大的淋巴小结的占比有增加趋势,面积小的淋巴小结占比有减少趋势;G+I组与I组相比,雏鸡盲肠扁桃体面积小的淋巴小结占比有增加趋势,面积大的淋巴小结占比有减少趋势;(3)与C组相比,雏鸡IBDV亚临床感染不同程度增加了盲肠扁桃体内巨噬细胞的数量,而Ghrelin的添加不同程度降低了盲肠扁桃体内巨噬细胞的数量,且1 dpi时差异显著(P﹤0.05)。3.Ghrelin添加对IBDV亚临床感染雏鸡盲肠扁桃体转录表达谱的影响(1)以Q value<0.05且log2(FC)>1为筛选标准,筛选G+I组与I组在1 dpi、3 dpi的差异表达水平。筛选结果表明:1 dpi时,G+I组与I组相比得到442个差异表达的基因,其中245个基因上调,197个基因下调。3 dpi时,G+I组与I组相比得到1911个差异表达的基因,其中238个基因上调,1673个基因下调。(2)通过GO和KEGG富集分析发现1 dpi和3 dpi时差异表达基因富集于直接或间接与炎症反应有关的通路。(3)挑选3个与炎症相关的炎症因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)进行q RT-PCR验证,验证结果表明,1 dpi时,G+I组IL-1β相对表达量显著低于I组(P﹤0.05);IL-8和TNF-α与I组相比差异不显著(P>0.05)。3 dpi时,G+I组IL-8、TNF-α的表达均显著低于I组(P﹤0.05)。验证结果与RNA seq数据表达量变化趋势一致。结论:(1)IBDV扩增和雏鸡IBDV亚临床感染模型建立成功。(2)Ghrelin添加可以不同程度降低IBDV亚临床感染雏鸡早期的体重增重减缓现象;促进法氏嚢指数的提高,降低了法氏嚢因IBDV亚临床感染导致的的萎缩。表明Ghrelin添加可以在一定程度上改善IBDV亚临床感染雏鸡的生产性能和法氏囊萎缩现象。(3)雏鸡IBDV亚临床感染时添加Ghrelin,降低了盲肠扁桃体固有层的厚度,淋巴小结面积变小,减少了巨噬细胞的浸润,降低了炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表达,因而降低了其免疫反应,但Ghrelin添加后雏鸡盲肠扁桃体内巨噬细胞的减少降低了IBDV扩散的风险。
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