论文部分内容阅读
昆虫表皮由内表皮、外表皮和上表皮构成,它们在蛋白质组成、生理结构和功能上都存在差异。表皮蛋白的种类和数量的变化是影响表皮结构的重要因素。甜菜夜蛾是一种世界性分布的多食性农业害虫。它可以为害多种农业及经济作物,例如棉花、芹菜、卷心菜、番茄、生菜和紫花苜蓿。近年来,甜菜夜蛾已对多种有机合成杀虫剂产生抗药性,包括有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类、吡啶类和苯甲酰脲类等。以昆虫表皮的重要组成元素——表皮蛋白为靶点,通过基因干扰、敲除等方法使重要的表皮蛋白基因表达降低或缺失,以破坏昆虫表皮组成与结构的完整性,可为害虫防控策略提供新思路。本研究采用RACE方法从Oh的甜菜夜蛾蛹皮中克隆得到三个表皮蛋白基因的全长序列。CPG316全长722bp,其中包含585bp的开放阅读框(ORF)编码194个氨基酸;CPG860全长710bp,其中包含585bp的开放阅读框(ORF)编码194个氨基酸;CPG4855全长863bp,其中包含630bp的开放阅读框(ORF)编码209个氨基酸。基于上述三个基因编码的氨基酸序列构建进化树,CPG316、CPG860和CPG4855的推导蛋白质序列均含有RR-2保守基序,这是昆虫表皮蛋白CPR家族成员所共有的保守结构域。接着,通过实时荧光定量PCR的方法研究了上述三个表皮蛋白基因从甜菜夜蛾3龄幼虫到24h蛹的表皮中的表达量。结果显示,CPG316在3龄幼虫表皮中呈现低表达,4龄至Oh蛹期表皮中CPG316表达量有所升高,2h蛹期达到峰值后迅速下降;CPG860和CPG4855在3龄幼虫表皮中呈现高表达,4龄至Oh蛹期表皮中CPG860和CPG4855的表达量逐渐降低,直至24h蛹中表达量降至最低。上述基因表达水平变化显示,CPG860和CPG4855可能与蛹表皮形成相关,CPG316则与上述两个基因功能不同。进而,采用RNAi技术研究上述三个基因的功能。分别将上述三个基因的dsRNA注射入甜菜夜蛾5龄幼虫,结果显示:CPG316的沉默导致试虫蛹期蜕皮不完全而死亡;CPG860的沉默导致试虫在5龄即死亡;高浓度的CPG4855 dsRNA造成试虫从5龄幼虫至预蛹的变态过程停止而死亡,低浓度时尽管试虫可以进入蛹期,但是蛹皮明显皱缩和变软。上述结果说明,上述三个表皮蛋白基因分别影响了甜菜夜蛾的表皮发育和柔韧性以及变态过程。