Shh与Wnt5a基因在NIPBL+/-小鼠模型肢芽的表达研究

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目的:Cornelia de Lange综合征(Cdls)为基因缺陷性疾病,多认为NIPBL基因突变可引起Cdls。NIPBL基因的突变可能对其调控的相关Shh、Wnt5a基因转录发生变化,从而对Wnt信号通路中关键因子功能产生影响,从而改变了成骨细胞的分化的方向等,最终导致长骨发育异常。因此,本研究以小鼠胚胎肢芽组织为研究对象,研究Shh、Wnt5a基因在NIPBL基因缺陷小鼠肢芽的表达情况,揭示Wnt信号通路相关因子在NIPBL+/-基因敲除小鼠中的作用,探讨两个基因与Cdls综合征的关系,从而为Cdls综合征的发病机制提供相关理论依据。方法:选择实验动物为NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠,57BL/6J,SPF级,购于浙江大学动物实验中心,动物饲养于石河子大学药学院动物实验中心,饲养条件平均温度25℃,湿度40%左右。NIPBL+/-小鼠,雄性体重35g,雌性体重30 g,20:00时将雌雄小鼠按2:1合笼,晨8:00检查雌鼠的阴栓,阳性阴栓小鼠当天12:00作为其胚胎0.5天。分别于胚胎10天、11天、12天取胎鼠进行实验验证。实验组,利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定后,可得到36只NIPBL+/-胎鼠肢芽,10天(n=12)、11天(n=12)、12天(n=12)。对照组,利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定,可得到36只NIPBL+/+胎鼠肢芽,10天(n=12)、11天(n=12)、12天(n=12),将胎鼠肢芽组织放入液氮中,15-20 min后,取出肢芽组织将其冷冻保存于-80℃冰箱内,备用。real-time PCR检测Shh、Wnt5a基因转录及表达水平。实验数据均为正态分布,均数±标准差(x-±s)表示,经SPSS 17.0统计软件分析,各组比较均采用单因素方差分析,且各组数据间Pearson相关分析,P<0.05有统计学差异,P<0.01有显著差异。结果:通过NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠获得NIPBL+/-小鼠模型,然后NIPBL+/-小鼠杂交,通过RT-PCR鉴定出实验组胎鼠及对照组胎鼠。利用real-time PCR检测Shh、Wnt5a基因转录水平,实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高,第11d达到最大值,第12d有下降。实验组各时间点与对照组各时间点比较,基因表达量较对照组表达量低,差异有统计学意义(P<0.01),组内各不同时间段之间比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。利用Western blot检测Shh、Wnt5a蛋白表达水平,实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高,第11d达到最大值,第12d有下降,实验组各时间点与对照组各时间点比较,基因表达量较对照组表达量低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:通过检测NIPBL+/-基因敲除胎鼠肢芽中Shh及Wnt5a基因的表达发现在孕鼠第10、11、12天两基因表达受到抑制,说明NIPBL对Wnt5a和Shh基因表达有影响,有助于人们更好的了解NIPBL+/-基因缺陷引起CdLs综合征骨畸形的发病机制。
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