目的：　　EHF（ETS同源因子/上皮特异性ETS因子家族成员3，ESE3）是E26转化特异性（ETS）超家族的成员。本课题组前期研究发现EHF在胰腺癌中为一种抑癌基因，通过上调E钙粘素的表达抑制胰腺癌侵袭迁移能力。在预实验中发现肿瘤EHF表达缺失与肿瘤浸润调节性T细胞、骨髓来源的抑制细胞以及CD8+T细胞比例相关。目前关于EHF的研究主要集中于前列腺癌以及树突细胞分化过程。在前列腺癌中，EHF缺失能够促进前列腺癌干性表型的出现以及转移能力的增加；在树突细胞中，EHF高表达能够促进树突细胞成熟。然而目前尚无关于肿瘤EHF缺失与免疫微环境的相关研究。近年来，以抗PD1/PD-L1为代表的免疫检查点治疗为胰腺癌带来了新的希望；然而，因胰腺癌高度免疫抑制的微环境特点，在现有的临床试验中，大部分胰腺癌患者对单药抗PD1/PD-L1治疗反应不佳。因此，目前临床亟需寻找有效的能够整体评估胰腺癌免疫微环境状态的分子标记以指导免疫治疗方案的精准选择。因此，设计该课题以明确胰腺肿瘤细胞中EHF表达缺失在胰腺癌免疫微环境重塑中的作用，并进一步探究EHF是否能够成为指导胰腺癌免疫治疗方案选择的生物标记。　　方法：　　1.通过C57BL/6免疫健全鼠皮下成瘤模型以及BALB/c裸鼠皮下成瘤模型探讨EHF在不同免疫状态小鼠中发挥的作用；通过C57BL/6小鼠皮下成瘤模型，采用流式细胞术方法检测Treg、MDSCs、CD8+T细胞浸润比例以及CD8+T细胞功能状态等，分析肿瘤EHF水平改变对肿瘤浸润免疫细胞成分及功能变化的影响。　　2.回顾性收集人胰腺癌石蜡标本96例进行EHF、FOXP3、CD33、CD8免疫荧光染色以及免疫组化共定位分析，探讨胰腺癌EHF水平与肿瘤浸润Treg、MDSCs、CD8+T细胞比例的关系。前瞻性收集45例新鲜胰腺癌组织标本，一部分进行Treg、MDSCs、CD8+T流式检测，另一部分制作成石蜡标本对EHF进行免疫组化染色，分析EHF表达水平与各免疫细胞亚群的相关性。同时，采用生存分析、单多因素回归分析及卡方检验分析EHF的预后作用、各群免疫细胞的预后作用以及EHF与各临床病理免疫参数的相关性。　　3.通过免疫细胞分选、接触式与非接触式共培养，明确EHF缺失诱导Treg增多的功能机制。从Treg趋化、Na?ve CD4向Treg诱导以及Treg增殖三个方面进行分析。并检测不同EHF表达水平的肿瘤诱导及增殖出的Treg的功能差异。　　4.分离人外周血单核细胞及小鼠骨髓细胞，通过接触式与非接触式共培养实验，明确EHF缺失促使肿瘤浸润MDSCs增多的功能机制。从MDSC诱导、增殖、趋化三个方面进行分析，并检测不同EHF表达水平的肿瘤诱导及增殖出的MDSCs的功能差异。　　5.通过实时定量PCR筛选找到受EHF调控并对Treg及MDSCs聚集有显著影响的下游基因。通过免疫组化、western-blot、ELISA检测等方法验证EHF对该下游基因的调控作用。通过ChIP以及双荧光素酶实验探索EHF对靶基因的调控机制。　　6.设计阻断实验明确EHF缺失引起免疫微环境重塑的机制。　　7.通过原位成瘤和皮下成瘤的动物模型以及小动物活体成像技术初步探索EHF作为一个分子标记对胰腺癌免疫治疗方法选择的指导意义。　　结果：　　1.在C57BL/6小鼠皮下接种PANC02-vector以及PANC02-EHF后可以明显观察到EHF显著抑制肿瘤生长；然而，在裸鼠中，PANC02-vector肿瘤与PANC02-EHF肿瘤大小并无明显差异。在C57BL/6小鼠中肿瘤EHF缺失能够引起Treg及MDSCs高浸润和CD8+T细胞比例的降低，CD8+T细胞凋亡及耗竭比例的升高及IFNγ+CD8+T细胞的减少。　　2.回顾性研究人胰腺癌组织标本96例以及前瞻性收集人胰腺癌新鲜组织标本45例，发现EHF与Treg、MDSCs的聚集水平呈显著负相关，与CD8+T细胞的聚集呈显著正相关。EHF、pTMN分期是OS和RFS的独立预后因素。　　3.通过分选人外周血Na?ve CD4+T细胞并与肿瘤细胞进行直接及间接共培养，发现肿瘤EHF缺失能够诱导Na?ve CD4+T细胞向Treg细胞转变增多并促进与其共培养的Treg细胞的局部增殖增多。EHF缺失的肿瘤诱导增殖出的Treg细胞免疫抑制功能更强。　　4.通过人外周血单核细胞与肿瘤细胞共培养以及小鼠骨髓细胞与鼠源胰腺癌细胞共培养实验发现EHF缺失的胰腺癌细胞能够趋化MDSCs局部聚集，诱导骨髓细胞向MDSCs的转变及增加MDSCs的局部增殖。EHF缺失的肿瘤诱导及增殖出的MDSCs具有更强的免疫抑制功能。　　5.EHF能够显著从蛋白水平以及mRNA水平负调控TGFβ1及GM-CSF的表达。查找TGFB1(TGFβ1)及CSF2（GM-CSF）启动子区EHF转录因子的结合位点并通过JASPAR数据库对结合位点进行评分。通过ChIP实验以及双荧光素酶实验发现EHF能够直接结合在TGFB1(TGFβ1)及CSF2（GM-CSF）的启动子区并负调控其转录活性。　　6.通过体外TGFβ1及GM-CSF阻断实验以及小鼠体内TGFβ1、GM-CSF联合阻断实验发现EHF缺失通过上调TGFβ1、GM-CSF表达水平促进肿瘤中Treg细胞及MDSCs聚集。　　7.在PANC02-vector及PANC02-EHF皮下成瘤的C57BL/6小鼠中给与Treg联合MDSCs清除治疗或联合同型对照治疗，发现PANC02-vector肿瘤能够从Treg联合MDSCs清除治疗中显著获益；PANC02-EHF肿瘤本身Treg、MDSCs低浸润，Treg联合MDSCs清除治疗获益不显著。　　8.在PANC02-vector及PANC02-EHF皮下成瘤及胰腺原位成瘤的C57BL/6动物模型中给与抗PD-1治疗或同型对照治疗，PANC02-EHF肿瘤能够显著从抗PD-1治疗中获益，表现为小鼠生存期的延长及瘤负荷的减低。PANC02-vector组不能从单药抗PD-1治疗中获益。　　结论：　　1.EHF在胰腺癌中的表达缺失能够促进肿瘤Treg细胞及MDSCs的聚集以及CD8+T细胞的减少。EHF表达水平及pTNM分期是胰腺癌的独立预后因素。　　2.EHF通过转录调控TGFB1(TGFβ1)及CSF2（GM-CSF）影响CD4+T细胞向Treg细胞的诱导，Treg细胞的局部增殖，骨髓细胞向MDSCs的诱导，MDSCs的增殖及趋化，进而影响CD8+T细胞的数目和功能。　　3.EHF是一个潜在的胰腺癌免疫微环境状态的评估指标，其表达水平有望指导胰腺癌免疫精准治疗方案选择。即，对于胰腺癌EHF高表达人群适宜给与单药抗PD-1治疗；对于EHF缺失的胰腺癌患者可能适于Treg、MDSCs清除方案或联合抗PD-1治疗。