HF443-GFP重组质粒的构建及在赤潮毒素检测中的初步应用

来源 :暨南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xinran200391127
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目的:以C-fos启动子为启动子、以绿色荧光蛋白为报告基因,构建重组质粒HF443-GFP;利用重组质粒转染人膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87细胞。培养体系中依次加入赤潮毒素和乌头碱,观察乌头碱诱导产生的绿色荧光蛋白表达的变化情况,通过荧光量的变化定量赤潮毒素,建立一种以细胞为基础的赤潮毒素检测方法。 方法:PCR扩增GFP基因并用HindⅢ和XbaⅠ双酶切,与同样经过HindⅢ和XbaⅠ双酶切并纯化的HF443质粒连接,构建重组质粒HF443-GFP。酶切鉴定重组HF443-GFP质粒并测序,对比序列和文献报道是否一致。利用脂质体LipofectAMINE2000将重组质粒HF443-GFP转入体外培养的BIU-87细胞,加入Na~+通道激活剂乌头碱诱导绿色荧光蛋白大量表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,检测乌头碱能否诱导BIU-87细胞中绿色荧光蛋白表达。在赤潮毒素检测时,细胞培养体系中先后加入不同浓度的赤潮毒素GTX(0.0033μmol/L、0.033μmol/L、0.33μmol/L)和乌头碱(0.033μmol/L),观察不同毒素水平下绿色荧光蛋白的表达情况,确定毒素和细胞中绿色荧光蛋白表达的相关性。 结论:成功构建了一个重组质粒HF443-GFP;重组质粒转染BIU-87细胞后加入乌头碱,荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光并能稳定存在3-4天,提示乌头碱可以诱导BIU-87细胞中绿色荧光蛋白的表达。在赤潮毒素检测实验中,细胞发出的荧光强度随毒素水平的增加而减弱,呈现一定的剂量依赖关系,提示用这种方法定量检测赤潮毒素是可行的。
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