【摘 要】
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目的:跨膜蛋白24（Transmembrane protein 24,TMEM24）在胰岛素的分泌过程中具有重要的调控作用,本研究旨在探讨棕榈酸（Palmitic acid,PA）干预对TMEM24的作用以及TMEM24基因表达水平对脂毒性β细胞功能的影响。方法:1.PA对TMEM24的影响:（1）采用体外培养的βTC6细胞,设置三个不同PA干预浓度,分别为0.25mmol/l、0.5mmol/l
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目的:跨膜蛋白24（Transmembrane protein 24,TMEM24）在胰岛素的分泌过程中具有重要的调控作用,本研究旨在探讨棕榈酸（Palmitic acid,PA）干预对TMEM24的作用以及TMEM24基因表达水平对脂毒性β细胞功能的影响。方法:1.PA对TMEM24的影响:（1）采用体外培养的βTC6细胞,设置三个不同PA干预浓度,分别为0.25mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l,干预24小时后,与空白组对照并进行后续实验:实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）检测TMEM24的m RNA水平、蛋白质印记（Westernblot,WB）检测TMEM24总蛋白表达量,酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测TMEM24的磷酸化蛋白水平及胰岛素分泌水平。（2）设置三个不同干预时间,通过1.0mmo/l PA分别干预24h、36h、48h后与空白组作对照进行以下实验:RT-q PCR检测TMEM24的m RNA水平、WB检测TMEM24蛋白表达水平、ELISA检测TMEM24的磷酸化水平及胰岛素分泌水平。2.TMEM24基因表达水平对脂毒性β细胞功能的影响:（1）构建TMEM24敲减（si RNA）组细胞及TMEM24过表达(TMEM24+/+)细胞:通过包装si RNA及TMEM24+/+慢病毒,以慢病毒转染βTC6细胞,病毒感染成功后,通过适当浓度的嘌呤霉素（Puromycin）对细胞进行筛选,而后进行培养、传代及冻存。（2）采用PA干预建立脂毒性β细胞模型,并分为NC+PA组、Vector+PA组、si RNA+PA组、TMEM24+/++PA组,而后采用流式技术检测细胞凋亡水平、ELISA检测胰岛素分泌水平、RT-q PCR检测Mafa、AKT的m RNA水平。WB检测Mafa、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、PKC、磷酸化PKC（p-PKC）、PI（4,5）P2蛋白含量。结果:1.PA导致TMEM24表达水平和磷酸化水平降低:（1）在浓度梯度部分,采用不同设定浓度干预24h后,PA以浓度依赖的方式使TMEM24 m RNA表达量、蛋白表达量、磷酸化蛋白量及葡萄糖刺激的胰岛素分泌（Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS）水平降低（P<0.05）。（2）时间梯度部分,采用1.0mmol/l的PA作为干预浓度,分别干预不同的时间,结果显示PA以时间依赖的方式使TMEM24的m RNA表达量、蛋白表达量、磷酸化蛋白含量及GSIS水平降低（P<0.05）。（3）浓度梯度和时间梯度各个分组TMEM24的m RNA和蛋白表达量分别与GSIS水平进行相关性分析,显示TMEM24的m RNA和蛋白表达量均与GSIS水平呈正相关且具有强相关性（P<0.05）。2.TMEM24对β细胞脂毒性功能障碍具有一定的拮抗作用:（1）TMEM24基因过表达可以增加Mafa、AKT、p-AKT、PI（4,5）P2表达水平（P<0.05）,同时拮抗脂毒性β细胞中PKC蛋白的激活,并使得p-PKC含量降低（P<0.05）;对β细胞中TMEM24基因进行敲减后则出现相反的结果。（2）TMEM24过表达可以减少脂毒性导致的β细胞的凋亡,使凋亡率明显下降（P<0.05）,而敲减该基因后细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。（3）TMEM24过表达可以增加脂毒性β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌GSIS量（P<0.05）,而敲减该基因后GSIS明显受损（P<0.05）,但TMEM24基因表达水平对基础胰岛素的分泌无影响。结论:1.PA产生的脂毒性损害导致TMEM24表达量减少及TMEM24功能失调。2.TMEM24过表达对β细胞的脂毒性功能障碍具有一定的拮抗作用。3.TMEM24敲减后可以加重PA导致的β细胞脂毒性功能障碍。
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