随着医学、生命科学、材料学的不断发展,组织工程取得了意义非凡的突破。众所周知,细胞、生长因子、支架材料是组织工程三要素。生长因子作为调控细胞各类活动及功能的重要信号分子,在组织工程研究中,是不可或缺的因素。由于生长因子多为蛋白质,其半衰期非常短,在游离的状态下,极其容易降解。在临床应用中,利用生长因子协助受损组织或器官的修复或替代过程中,生长因子很难保持长久的活性。想要使游离的生长因子发挥生物学作用,需要向体内运输大量的游离的生长因子。而向体内运送大量的生长因子,不仅花费高、效率低,而且,可能影响正常组织器官的生长或功能,例如,大量的生长因子可能会刺激肿瘤的生成,可能会损伤组织和细胞。将生长因子固定在组织工程支架材料上,成为了一种可行的对无机材料进行修饰的方法。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种由活细胞分泌的具有促进血管生成的信号大分子。在受损组织的修复过程中或在工程化的组织器官移植过程中,血管生成是保证组织器官具有或恢复生物学活性的至关重要的一步。在工程化的组织或器官中引入VEGF,是一种较为有效的提高移植物的存活率、促进细胞与组织再生的手段。但是,同其他生长因子相似,由于生长因子在极微量的条件下便可调控细胞的行为与功能,向移植受体内引入大量的VEGF很可能引起组织受损或功能紊乱等。将VEGF固定在生物材料上,是一种新的研究思路。而转肽酶(sortase)的发现为蛋白质修饰提供了一个强有力的工具。转肽酶是一种存在于几乎所有的革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌中的一种可以修饰表面蛋白的催化酶。其可以特异性的识别和裂解羧基末端的分选信号,实现对蛋白质的翻译后修饰。其中,sortase A亚型,可以高度识别蛋白质N端的LPXTGG位点(X为任意氨基酸),并裂解位于苏氨酸(Threonine,T)及甘氨酸(Glycine,G)之间的肽键,此时,向反应体系中引入一段含有低聚甘氨酸的肽段,可以发生亲核反应,将蛋白质与含有低聚甘氨酸的肽段连接起来,实现高效,特异性的蛋白质修饰。所以,在本课题中,课题组利用sortase作为蛋白质的修饰工具,将生长因子与具有较强粘附特性的多巴胺多肽相连接,利用多巴胺有强大的粘附特性,使修饰后的VEGF固定在材料表面,使修饰后的材料具有生物学活性。本课题的基本实验方法如下:1.应用基因工程的方法构建含有vegf基因的质粒通过使用DNA聚合酶与适当的基因引物,利用PCR技术合成了vegf基因以及vegf-sor基因。vegf-sor基因含有编码sortase识别序列的密码子,在适当的表达载体中可以使表达出的蛋白质带有sortase识别序列,从而可以在后续的实验中,利用sortase酶对进行蛋白质进行翻译后修饰。同时,利用基因工程的手段合成了p ET15b载体基因,并将所合成vegf基因以及vegf-sor基因利用In-fusion的技术,将目的基因插入载体,成功地构建出含有目的基因的两种质粒,即含vegf基因的质粒与vegf-sor基因的质粒。2.应用蛋白质工程技术表达和纯化目的蛋白质通过将人重组质粒转入到大肠杆菌表达体系中,利用IPTG诱导剂诱导大肠杆菌特异性的表达目的蛋白,VEGF与带有sortase识别序列LPETGG的VEGF(以下简称为VEGF-Sor)VEGF-Sor。大肠杆菌所表达的蛋白以包涵体的形式存在,通过尿素等试剂,将蛋白质从包涵体中裂解出来,并利用组蛋白标签亲和层析对蛋白质进行纯化。纯化后的蛋白质不含有二级结构,不含有生物学活性。通过利用谷胱甘肽等试剂可以辅助蛋白质形成二硫键,形成具有生物学活性的蛋白质。在蛋白质纯化后,对蛋白质进行体外折叠,生成具有生物学活性的VEGF。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、western blot、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等方法对所制备的人重组VEGF进行样品纯度、分子量、抗原抗体反应等方面进行检测。3.固相合成法制备DOPA多肽利用固相合成技术,合成所需的多聚DOPA肽段,其氨基酸序列为GGGXKXKXHHHHHH,(X=DOPA)。所合成的肽段经过LC-MS分析、纯化。4.利用转肽酶制备粘附性的VEGF(VEGF-DOPA,VEGF-D)将人重组VEGF-Sor与DOPA多肽相连接,制备具有粘附性的VEGF,并对其进行检测。通过SDS-PAGE、western blot、液相色谱—三重串联四级杆液质联用仪(LC-MS/MS)进行样品纯度、分子量及抗体结合能力进行测定;并通过石英微晶天平(QCM-D)对其粘附性进行测定,利用细胞实验对其进行生物学活性的测定。5.利用重组粘附性的VEGF修饰生物材料表面将VEGF-DOPA固定在氧化钛涂层玻璃(以下简称钛片)、钴铬合金(Co/Cr)表面,并对其生物学活性进行测定。结论:通过利用转肽酶,将具有粘附特性的DOPA多肽与VEGF生长因子相结合,制备有粘附功能的VEGF-DOPA,黏附能力提高2至3倍。并将其固定在无机生物材料,钛、钴铬合金上,构建具有生物学活性的组织工程材料。实验结果表明,修饰后的生物材料,能够稳定的、长期的保持生物学活性,促进血管内皮细胞的增殖,细胞增殖率提高80%。利用生长因子固定的方式修饰无机材料,有望提高无机材料在组织工程应用中的生物相容性,促进细胞黏附、迁移、增殖、分化等。在应用组织工程技术对受损组织和器官进行修复或替代时,预期通过对无机材料的表面修饰,提高植入物在体内的存活率、形态维持时间、功能发挥等。