超氧化物歧化酶（EC1.15.1.1）是一类金属酶，广泛存在于需氧的和厌氧的生物体各组织内。按金属辅基的不同可分为Cu,Zn-SOD，Mn-SOD与Fe-SOD。Cu,Zn-SOD主要存在于真核生物的细胞质和过氧化物酶小，同时它也存在于植物的叶绿体中。在哺乳动物体内存在两种类型的Cu,Zn-SOD，一种是细胞内存在形式，叫细胞内Cu,Zn-SOD（简称Cu,Zn-SOD），另一种是细胞外存在形式，叫细胞外Cu,Zn-SOD（简称EC-SOD），二者在催化歧化反应时有相同的速率和相似的动力学常数。 研究表明不同来源的Cu,Zn-SOD之间，显示出明显的进化保守性和高度的序列同源性。在人和牛红细胞Cu,Zn-SOD之间，全序列同源性为80％，在人、牛、马三种来源的酶之间，全序列同源性为74.5％，而在酵母与牛红细胞Cu,Zn-SOD之间，同源性也高达55％，同时考虑这四种酶，全序列同源性为49.6％。由上述四种来源的细胞色素C，序列同源性为55.7％。细胞色素C是进化上高度保守性的典型蛋白质分子，所以可以说Cu,Zn-SOD也是一种进化上高度保守的酶。 Cu,Zn-SOD是体内超氧负离子自由基的专一清除剂。在体内自由基的产生与消除的动态平衡中起关键作用，其调节失衡导致炎症、缺血性再灌注损伤、自身免疫性疾病和老年白内障等，因此研究开发SOD倍受人们的重视。但传统工艺生产的SOD均来源于动物血，易受污染且有免疫原性。为了克服上述缺点，根据报道的Cu,Zn-SOD的cDNA序列，我们设计并合成了寡核苷酸引物，利用RT-PCR技术，从人胎肝组织中扩增了人Cu,Zn-SOD的cDNA，测序结果与文献报道完全—致。经酶切后定向克隆于载体pBV220中，构建了高效表达载体pBVSOD（4156bp），转化至大肠杆菌，获得了有实用意义的上程菌，经升温诱导表达目的基因，得到产物占菌体总蛋白的30.17％，并对酶进行了有效的分离纯化。 但是天然SOD在临床应用中受到很大的限制，其中主要因素就是 东 北 师 死 人 学 博 士 学 位 论 文‘1”（帅J，／I－仆川；WDI、11’。。川／J－O．1（）川1。。以’．SOD的C木bZ6川＋U测1－小；咖＄们X，。川g；’f1小M聊川JIfi刷11momU【－＃，J、W卜J””卜3’）J，w‘JI（）。J州D人］1比，川D’以仙1］盯－KRJ、从人)ID。夕叫（l咐．耶」HIIC－SOI）l’fVCI)NA if。)伽h顺。fiw，HEC－SOD仪／l－h风。侧9讪。I。沁门叽厂川们mU］－发，我f门虽然尝试了树11人仕＃下，Vll PBV220、PI｛T”系)雌f叩IP（i＊X－2『LK残体等，以1＊fi＜ 休5卜洲卜D侧）／问J’，pl5VZ川人卜。卜小厂M于，pEI系＊W人1＊人舌 于，叩M一2『厂K为切一冰 人川汀，希毕自旨 人J枷1【 【！。人丛，川均木获得成功。 荆1’I七虑＊u，人；－X（）I)和！川（’－S（）IJ的仇缺点，将HRC下（川）的＊－牙木和特。仕‘iCu，h；－SOD啊4．c件纠八起术（卜内此领域尚M个D’【），刊川酶分子体外定向进化jjt｝；对 CLI，Zfl－SOD和 HEC－SOD ）JI以Lgljft，以3t)J得到女川的酶。 定向进化是最近儿午发展起火的基因工程和蛋l”1质工程的新策略u它通过在试管小扮拟Hi！t剂11人生的进化过柑米实现对牛物人分厂〔山人卜进化。为厂能够在‘大验V小 ｛i)卜C人 C［J，Zn－SOD的进化汀人，我们必须X重考虑。个力血的问租，第 个是要获得合适的大变阶川作进化的材料：第＊：个足尘七“适宜的筛选压力，指导牛物人分”仙特定的人向淡变：第：个足要殁)良灯的筛选方法，使我们能快检选抒出所需要的优势突变休。 我们人大然氧川力和超氧儿力卜经过丑轮进化，分别对－－。厂余株能够在达JJ Cu，Zn－S（）D活力的大企什进行筛选，经过酶活力杠］筛)厂，村几中细胞水平活力较高的40株进计了顺序分析，我们发现在人然凤儿力下得到的突变仆毡木卜为小们－大变，突变体的活力没有优八。在；攫氧压力卜得到的突变体虽然人多数出均为中性突变和负。叮大变，filH我什J发工见了一个颇人川卜亡a义问C；；，＊n－SOD R变体卜OL订以1个。。／．＼大分 卜hi45（＊＊C一＊＊＊，W旧飞G丁G一0TA卜G山133一Gll八＊八八一C’八八），Alal40—Gb＼G＜”1”一GGT)。几中，汕内个大变人人义大、Q，／If大J蹩＊ 的密码厂介人多 杆的中的仗川频率有所提高口A且＊1叩一＊ 这个大·炒。】能冰卜折柠的形成丫j人 川让足G山133－G！n穴·阶K伙衍探讨， 床 北 师 死 大 学 俗 士 学 位 论 又 ＊IU133恰好位于底物通道的外缘，直接影响着底物的通过。那么， Glul33—Gin由电正性氨基酸变为电中性氨基酸，一定会对底物扩散 产生深刻的影响。考虑到超氧负离子为电负性，这个突变可能为了保 证更多的超氧负离子进入活性部位，这对于菌体抵抗较严重的氧损伤 是有利的。 我们从随机组合肽库的肝素亲和筛选结果出发，设计了一肝素亲 和肽序列。首先用化学法合成了两条有 15hp互补的寡核昔酸链，经退 火、补?