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子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)是一种女性生殖系统习见的恶性肿瘤,近些年来发病率呈上升趋势。无孕激素拮抗的雌二醇长期刺激与之密切相关,但雌二醇具体如何调节细胞增殖的作用机制尚无确切结论。本课题组前期研究表明,雌二醇能够通过PI3K/Akt信号通路促进子宫内膜癌细胞生成VEGF、bFGF、IL-8等,从而促进子宫内膜癌细胞的发生发展。为进一步阐明子宫内膜癌的发病机制,本研究选取PI3K为靶点,利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因,探究其对雌二醇作用子宫内膜癌Ishikawa细胞的影响及其潜在作用机制。并观察PI3K基因沉默对子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤模型的影响,初步探讨PI3K基因能否成为子宫内膜癌分子治疗的新靶点。第一部分慢病毒shRNA载体构建并建立稳定转染的Ishikawa细胞株[目的]本课题组前期发现雌二醇可以通过PI3K/Akt信号通路促进子宫内膜癌细胞产生VEGF、bFGF、IL-8等,从而促进子宫内膜癌细胞的发生发展,为明确PI3K/Akt信号传导通路对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的相关影响机制,我们利用RNAi抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中的PI3K基因,并筛选稳定表达的细胞株,为探究PI3K基因低表达对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的影响奠定基础。[方法]1.设计合成4组特异性针对PI3K基因的siRNA,构建shRNA质粒载体,感染Ishikawa细胞。2.利用RT-PCR和Western blot技术检测各组对目的基因的抑制效果,筛选出沉默效果最佳的靶点。3.将选取的最佳靶点进行包装成慢病毒shRNA载体,感染Ishikawa细胞。4.将感染目的基因的细胞Ishikawa,经流式分选获得稳定的细胞株,采用RT-PCR和Western blot实验检测对目的基因的抑制效果。[结果]1.RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点,siRNA序列为：GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA2.经测序证实,运用特异性针对PI3K基因的siRNA,成功构建了慢病毒shRNA载体,包装滴度为8×108TU/ml。感染Ishikawa细胞,荧光倒置显微镜下观察及流式细胞仪检测,显示各组感染效率均在90%以上,病毒感染成功。3.经流式细胞仪分选后,RT-PCR和Western blot验证干扰效率,获得稳定转染的细胞株。[结论]RNA干扰技术可有效地抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,为后续实验奠定基础。第二部分 慢病毒介导的PI3K基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响[目的]利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的PI3K基因的表达,检测PI3K基因低表达后对雌二醇作用Ishikawa细胞后相关基因、蛋白的影响,观察对其存活能力、周期、凋亡影响,探究PI3K基因低表达后对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响及其潜在机制。[方法]1.RT-PCR和Western blot实验检测雌二醇作用感染前后Ishikawa细胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表达。2.MTT实验检测感染前后细胞的生长情况,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞生存率的影响。3.细胞迁移实验Transwell检测感染前后细胞的体外迁移能力,分析PI3K基因沉默前后对Ishikawa细胞的体外迁移能力的影响。4.流式细胞仪检测经雌二醇处理后各组细胞周期及凋亡率的变化,分析PI3K基因沉默后对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响。[结果]1.E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的VEGF、bFGF基因和蛋白较对照组明显增加(P<0.05)；NC组与Ishikawa组相比较差异无统计学意义(p>0.05); PI3K组细胞VEGF、bFGF基因和蛋白的表达较Ishikawa组相比明显减少,差别有统计学意义(p<0.05)2.MTT实验结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,细胞的倍增时间较对照组明显加快(P<0.05)；NC组的细胞倍增时间与Ishikawa组相比较差别无统计学意义(p>0.05); PI3K组细胞的倍增时间较Ishikawa组相比明显延长,差别有统计学意义(p<0.05)。3.迁移实验显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,穿过微孔的细胞数较对照组明显增加(P<0.05);PI3K组细胞穿过微孔的细胞个数比Ishikawa组明显减少,差别有统计学意义(p<0.05),表明PI3K低表达可以干扰E2上调子宫内膜癌细胞迁移的能力。4.细胞凋亡结果显示：E2作用未转染的Ishikawa细胞后,比对照组总凋亡率(%)下降,差别有统计学意义(p<0.05)；NC组的细胞总凋亡率(%)与Ishikawa组差别无统计学意义(p>0.05); PI3K组细胞比Ishikawa组中晚期凋亡增加,总凋亡率(%)增加,差别有统计学意义(p<0.05)。5.细胞周期实验结果显示,E2作用于未转染的Ishikawa细胞后,比对照组的G0/G1期比率下降,差别有统计学意义(p<0.05)；NC组与Ishikawa组相比,各期比例差别无统计学意义(p>0.05);PI3K组细胞与Ishikawa组相比,G0/G1期增加,S期和G2期减少,差别有统计学意义(p<0.05)。[结论]PI3K基因低表达可以干扰E2在基因、蛋白水平激活子宫内膜癌细胞产生VEGF、bFGF,可以下调E2对子宫内膜癌细胞增殖的促进作用和凋亡机制作用,提示PI3K基因可能成为子宫内膜癌分子治疗的潜在靶点。第三部分构建PI3K基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型[目的]构建PI3K基因低表达Ishikawa细胞的裸鼠移植瘤模型,观察PI3K基因沉默对子宫内膜癌裸鼠移植瘤生长的影响,进一步研究PI3K/Akt信号通路与子宫内膜癌的相关性,为子宫内膜癌的基因治疗提供动物实验依据。[方法]将BALB/C裸鼠随机分为3组,每组6只。将未转染组(Ishikawa)细胞、阴性对照组(NC)细胞及PI3K基因沉默组(PI3K-shRNA)细胞分别接种于裸鼠右侧背部。观察移植瘤成瘤情况及肿瘤生长情况,成瘤后,用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)。按照肿瘤体积计算公式：V=0.5xaxb2来计算肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线。提取移植瘤组织蛋白质,应用Western Blot检测各组PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。[结果]成功构建子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型。Ishikawa组与NC组裸鼠移植体积增长没有明显差别(p>0.05);PI3K基因低表达的PI3K组移植瘤增长较Ishikawa组明显减慢,差异具有统计学意义。与Ishikawa组、NC组相比,PI3K组裸鼠移植瘤瘤体重量明显小于其它两组p<0.05),而Ishikawa组与NC组瘤体重量差别无统计学意义(p>0.05)。实验PI3K组移植瘤PI3K蛋白的表达量较Ishikawa组及NC组显著降低(P<0.05),而Ishikawa组与NC组间无显著差异(p>0.05),提示慢病毒介导的PI3K基因RNA干扰载体在体内仍能稳定遗传并高效表达。PI3K组p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表达量比Ishikawa组和NC组均显著降低(P<0.05)。[结论]PI3K基因低表达抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,提示PI3K基因有可能成为子宫内膜癌的分子靶点。