【摘 要】
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尖吻蝮（Agkistrodon acutus）是蛇亚目蝰蛇科蝮亚科下的一种单型毒蛇,主要分布于我国的华东地区,是国家二级濒危保护陆生野生动物。尖吻蝮蛇蛇毒（Agkistrodon acutus venom,AAV）中主要活性成分为蛋白质和多肽,具有抗心血管疾病、抗血栓、抗肿瘤、镇痛、抗炎抗菌等药理作用。蛇毒类凝血酶制剂作为一类抗血栓药,可通过水解体内纤维蛋白原,降低血浆中的纤维蛋白原含量,从而降低
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尖吻蝮（Agkistrodon acutus）是蛇亚目蝰蛇科蝮亚科下的一种单型毒蛇,主要分布于我国的华东地区,是国家二级濒危保护陆生野生动物。尖吻蝮蛇蛇毒（Agkistrodon acutus venom,AAV）中主要活性成分为蛋白质和多肽,具有抗心血管疾病、抗血栓、抗肿瘤、镇痛、抗炎抗菌等药理作用。蛇毒类凝血酶制剂作为一类抗血栓药,可通过水解体内纤维蛋白原,降低血浆中的纤维蛋白原含量,从而降低血液粘滞度,改善血液的流动性,起到抗血栓作用。本研究以尖吻蝮蛇蛇毒为研究对象,综合运用多种层析技术从中纯化出一种类凝血酶并对其性质进行了研究,主要研究工作如下。通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Heparin-Sepharose 6 Fast Flow亲和层析、Sephacryl S-200HR凝胶层析三步层析法从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出一种准确分子量为30391 Da的类凝血酶,并命名为TLE-Ⅰ。（1）通过SDS-PAGE电泳鉴定,TLE-Ⅰ显示为一条带;（2）通过分子筛高效液相色谱、C18反相高效液相色谱分析显示TLE-Ⅰ的纯度分别为100%和92.888%;（3）通过Folin-酚试剂法测得TLE-Ⅰ的蛋白质浓度为0.616 mg/m L,总蛋白含量为7.392mg,且经三步柱层析后总提纯倍率约为618倍;（4）测得TLE-Ⅰ的酶活力为25056U,比活为3389 U/mg;（5）实验结果显示TLE-Ⅰ的最适反应p H为7.5,最适反应温度为45℃;（6）纤维蛋白原水解实验结果显示TLE-Ⅰ能够水解纤维蛋白原,且水解活性较强;（7）通过LC-MS蛋白质鉴定及氨基酸序列测定,TLE-Ⅰ的氨基酸序列为VIGGVECDINEHRFLV,其肽段覆盖率、氨基酸序列与蛋白质数据库Uniprot收录的编号为“Q9I8X2”的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶一致,确定TLE-Ⅰ为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。综上所述,本实验研究了一种从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法,利用蛋白质所带电荷不同以及基于肝素抗凝作用的生物学活性、蛋白质间分子量的差异实现目标组分的分离纯化,其提纯方法简单,纯化效率高,为进一步开发和利用蛇毒类凝血酶提供了一条有效途径。
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