目的:探讨人角膜缘上皮细胞(corneal limbal epithelial cells,CLECs)体外分离、纯化、建系的条件;探讨结合异种角膜基质板层,借助旋转培养形成的气液界面,进行板层生物角膜构建的可行性.结论:1.采用消化法、组织块培养法、饲养层培养法培养原代CLECs增殖能力强,分化程度低,其中组织块培养法和饲养层培养法更有利于细胞增殖活性的保持.2.三种分离CLSCs的方法中,以Ⅳ型胶原差异粘附法分离效果最好,细胞活性最高.密度梯度离心法在分离非活性细胞有一定优势,采用密度梯度在1.013~1.068g/ml的分离溶液,可分离得到CLSCs,但是分离得到的CLSCs纯度不高,细胞活性稍差;荧光激活细胞分离法的分离效果最差,回收率最低,细胞容易污染,死亡.3.原代CLECs在体外成功传到38代后,细胞仍保持较高的增殖能力和表达角膜上皮细胞的特异性蛋白(CK3/12),细胞无成瘤性.但是细胞的染色体数目和核型发生了变化.4.第15代CLECs在旋转培养形成的气液界面培养中可以在猪角膜基质上形成复层角膜上皮,但是上皮细胞和基质之间的粘附不紧,此外手工剖切的基质板层表面粗糙,还需要进一步改进.