研究背景:我国是世界上高原面积最大、海拔最高、居住人口最多的国家,边境线长达4000公里,其军事和战略地位十分重要。高原有着特殊的自然环境,随着海拔升高,气压降低,空气中的氧分压亦不断降低,人体对这种低压低氧环境的适应能力降低或失调,极易发生高原病,严重威胁着急进和驻训高原部队官兵的身体健康与生命安全,积极寻找高原病防治策略是确保高原部队战斗力、维护边境稳定、保障国家安全的迫切需要。进入高原地区后,低压和低氧(Hypoxia,HYP)是最先被机体感受到的环境因素,会引起机体一系列的生理功能障碍以及病理变化,主要表现为出现一系列非特异性临床综合征(包括呼吸困难、头疼、失眠、注意力下降等),以及危及生命的高原肺水肿(High altitude pulmonary edema,HAPE)和高原脑水肿(High altitude cerebral edema,HACE)等急性高原病(Acute mountain sick,AMS),还会出现包括情绪及神经认知能力的损害。大脑作为人体的核心器官氧耗量大(相当于人体总氧耗量的20%),缺氧会导致脑神经细胞代谢异常、脑血管调节失衡,并直接损害神经元从而引发一系列神经精神改变,比如失眠、记忆力衰退、认知功能下降、对外界反应的灵敏度以及行为异常等,严重者会出现睡眠呼吸功能障碍,甚至出现烦躁、惊厥、昏迷或共济失调等症状。如何防治高原低压低氧对大脑的损伤作用及其对高级精神活动的影响已引起了众多研究者的关注,并成为高原医学研究的前沿和热点,特别是基于军事训练、军事决策、军事作业及未来战争的需要,对高原特殊作业环境下官兵大脑认知功能损伤的预防保护就尤显重要。目前针对高原低压低氧环境对大脑认知功能损伤的防治措施主要依靠缺氧习服和临床改善认知障碍的药物(加兰他敏、依拉地平、中药提取物等)干预来实现。然而,我国尚缺乏改善高原认知功能障碍的专门药物,积极寻找新的药物作用靶点并研发有关防治药物是高原医学急需解决的问题。松果菊苷(Echinacoside,ECH),是从我国传统的补益中药管花肉苁蓉Cistanche tubulosa(Scgrenk)R.Wigh中提取分离得到的一种天然苯乙醇苷类化合物。已有研究表明,ECH可以提高人体内的抗氧化水平、抗神经细胞凋亡和改善学习记忆能力并具有免疫调节等一系列作用。ECH还能促进机体脑内胆碱能神经递质水平恢复、改善胆碱能系统功能、提高总抗氧化能力、促进核酸与蛋白质合成、增强免疫功能并提高学习记忆能力。对其在高原特殊地区的脑保护作用及其机制进行深入研究,有望为从传统中药和天然产物中寻找具有改善高原认知功能障碍的新药提供实验依据,为防治高原低氧脑损伤疾病提供新的作用靶点,也为临床治疗提供新思路。研究目的:本课题拟采用低压氧舱构建低压低氧小鼠认知损伤模型,从行为学、脑组织结构、氧化应激、Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨ECH改善高原缺氧小鼠认知功能的效应及其机制;同时通过体外细胞学实验,进一步探讨ECH预处理对低氧条件下HT22细胞能否减轻氧化应激损伤以及Keap1/Nrf2/ARE信号通路是否介导其保护效应,以期为ECH的临床新用途提供实验依据。研究方法:一、ECH对高原低压低氧所致C57小鼠认知功能损伤的保护作用1、对C57小鼠进行Morris水迷宫定位航行训练,记录小鼠到平台的时间(逃避潜伏期)、路线轨迹和平均游泳速度。除Control组外其余各组均连续7d被放入低压氧舱中。低压低氧实验后,移除平台对每组小鼠进行空间探索记忆能力测试实验,记录小鼠在目标象限内穿越平台的次数、目标象限停留时间百分比和目标象限停留路径百分比。2、进行动物行为学测试,观察记录小鼠在120s内水平活动与垂直活动的次数。低压低氧实验后,再次观察记录每组小鼠在120s内水平活动与垂直活动的次数是否有差异。3、使用HE染色法观察各组C57小鼠海马CA1区锥体细胞的形态并计算分析正常锥体细胞数量。4、使用透射电子显微镜观察和采集图像分析各组C57小鼠海马细胞内线粒体的情况。二、ECH对高原低压低氧所致C57小鼠认知功能损伤的机制研究1、剥离小鼠海马组织,取适量组织匀浆测定SOD、CAT、GSH-Px和MDA的含量。2、RT-PCR检测海马组织中Nrf2、HO-1,NQO1 andγ-GCS的mRNA表达。3、Western blot检测海马组织中Keap1、Nrf2、HO-1,NQO1和γ-GCS蛋白含量表达。4、免疫荧光法(IF)检测海马组织中ROS的含量表达,计算分析其积分光密度(IOD)。三、ECH对缺氧所致HT22细胞缺氧损伤的保护作用1、小鼠海马神经元细胞系HT22细胞缺氧培养6h后检测细胞增殖情况,并观察HT22细胞数量和形态变化。2、HT22细胞裂解均匀后收集上清液,检测SOD、CAT、GSH-Px抗氧化酶活性和MDA含量水平。3、Western blot检测HT22细胞中Keap1和Nrf2蛋白含量表达。研究结果:一、ECH对高原低压低氧所致C57小鼠认知功能损伤的保护作用1、Morris水迷宫结果显示,定位航行训练的学习效果随着训练时间的延长而提升,小鼠的逃避潜伏期,游泳路径和平均游泳速度有明显的进步。低压低氧可明显降低小鼠的目标象限停留时间百分比、目标象限停留路径百分比和穿越平台次数,而ECH和GBE能显著提高小鼠的目标象限停留时间百分比、目标象限停留路径百分比和穿越平台次数,该作用与ECH的浓度呈剂量依赖性。2、第一次动物行为学测试结果显示各组间水平和垂直活动无明显差异,说明小鼠行为学的一致性。第二次动物行为学测试,低压低氧可明显提高小鼠的水平活动,降低其垂直活动。而ECH和GBE能显著降低小鼠的水平活动,提高其垂直活动,且这种作用与ECH的浓度成正比。3、HE染色结果提示,低压低氧会导致小鼠海马CA1区锥体细胞排列松散和固缩深染。ECH各给药组小鼠海马CA1区锥体细胞数量较多,排列相对紧密,少量或极少出现固缩深染,且这种作用与ECH的浓度成正比。4、透射电镜结果显示正常小鼠海马细胞内线粒体形态以管状为主,结构无明显变化。低压低氧会导致小鼠海马细胞内部分线粒体肿胀和扩张,显示内部嵴结构缺失。ECH各给药组中小鼠海马细胞内存在数个较大但形态完整且结构正常的线粒体。线粒体的形态学分析表明,与暴露于低压低氧的小鼠相比,ECH剂量越高,小鼠线粒体结构完整度越好。二、ECH对高原低压低氧所致C57小鼠认知功能损伤的机制研究1、低压低氧会导致小鼠海马组织中SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低,MDA含量显著性增加。ECH各给药组小鼠海马组织中SOD、CAT、GSH-Px活性均有显著增加,MDA含量有显著性降低。2、RT-PCR结果显示,低压低氧会导致小鼠海马组织中Nrf2表达升高,HO-1、NQO1、γ-GCS表达均降低。ECH各给药组小鼠海马组织中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表达均显著升高,且这种作用与ECH的浓度成正相关。3、Western blot结果显示,低压低氧会导致小鼠海马组织中Nrf2表达升高,HO-1、NQO1、γ-GCS表达均降低。ECH各给药组小鼠海马组织中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表达均显著升高,且这种作用与ECH的浓度成正相关。4、免疫荧光结果显示,低压低氧可导致海马CA1区细胞内ROS的产生,而ECH和GBE能明显地抑制海马细胞CA1区内ROS的产生,随着ECH的浓度越高,这种抑制海马细胞CA1区内ROS产生的作用就越大。三、ECH对缺氧所致HT22细胞缺氧损伤的保护作用1、HT22细胞增殖实验显示,缺氧诱导会降低细胞活力,引起细胞形态的明显改变,导致细胞收缩变圆、脱离培养板。在缺氧培养中,ECH预处理HT22细胞可以抑制细胞活力的降低和细胞形态的改变。2、缺氧会导致HT22细胞中SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶活性均显著下调,MDA的含量显著上调。ECH各给药组HT22细胞中SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶活性均显著上调,MDA的含量显著下调,且ECH-H组效果最明显。3、Western blot结果显示,缺氧会导致HT22细胞中Keap1表达显著上升,Nrf2表达略微上升。ECH各给药组HT22细胞中Keap1表达显著下降,Nrf2表达显著上升,且ECH-H组效果最明显。研究结论:1、行为学实验表明,低压低氧能引起C57小鼠的空间认知功能损伤,ECH对低压低氧条件下的空间认知损伤有一定的保护作用。2、形态学实验提示,ECH对C57小鼠海马组织细胞的线粒体结构具有良好的保护作用。3、作用机制研究表明,低压低氧会造成C57小鼠海马锥体细胞形态的损伤,而ECH对这种损伤具有一定的保护作用,同时,ECH对体外海马神经元HT22细胞缺氧干预研究表明,其作用机制可能与ECH的抗氧化活性相关,同时ECH激活了Keap1/Nrf2/ARE通路并提高了海马组织中与ROS相关的SOD、CAT、GSH-Px活性,降低了MDA的含量,从而显著抑制了低压低氧造成的氧化应激损伤。4、ECH预处理是缓解高原低压低氧受试小鼠大脑损伤的有效策略之一,可为下一步开发防治低压低氧环境下认知损害有关创新药物的发现提供新思路。