【摘 要】
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目的:体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,并利用长波长碳点（carbon dots,CDs）标记细胞,探讨碳点的示踪能力及对细胞成骨分化的影响。方法:1.分离培养3周龄雄性SD大鼠（由南京医科大学实验动物中心提供）的BMSCs,通过光学显微镜观察其细胞形态,通过流式细胞仪进行细胞表型鉴定。通过碱性磷酸酶（alka
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目的:体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,并利用长波长碳点（carbon dots,CDs）标记细胞,探讨碳点的示踪能力及对细胞成骨分化的影响。方法:1.分离培养3周龄雄性SD大鼠（由南京医科大学实验动物中心提供）的BMSCs,通过光学显微镜观察其细胞形态,通过流式细胞仪进行细胞表型鉴定。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色与茜素红染色鉴定细胞成骨分化潜力,通过油红O染色鉴定细胞的成脂分化潜力。2.用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）、傅立叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR）等方法对CDs进行表征;用CCK-8法检测1、3、5、7天时CDs对BMSCs细胞活性的影响;利用流式细胞仪测定CDs标记细胞效率的浓度依赖性;利用多种胞吞抑制剂与4℃低温培养,探讨细胞摄取CDs的途径;在共聚焦显微镜下观察BMSCs的成像特点,通过绿色溶酶体荧光探针荧光共定位以确认CDs的胞内分布,同时进行长时间示踪;成骨诱导4、7天时通过检测ALP活性来测定BMSCs的早期成骨分化水平;成骨诱导21天时通过茜素红染色对BMSCs细胞外基质矿化水平进行测定;成骨诱导7、14天时通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）测定成骨相关基因OPN、OCN、Runx2、Osterix相对于内参基因的表达量。结果:1.成功对大鼠BMSCs进行体外分离、传代及流式细胞仪表型鉴定、ALP、茜素红与油红O染色检测。2.TEM结果显示CDs为平均粒径2.17 nm的球形颗粒;FT-IR结果显示CDs表面富含羟基、氨基等基团;CCK-8结果显示第1天与对照组相比,50,100μg/m L CDs组细胞活性明显升高（P<0.05）,300μg/m L CDs组细胞活性有降低（P<0.05）但仍高于80%;流式细胞术结果显示细胞标记效率随CDs浓度升高而上升;激光共聚焦显微镜成像结果显示BMSCs与CDs共培养后在561nm波长的激发下呈红色荧光,CDs红色荧光部分位于细胞质,部分与溶酶体探针的绿色荧光重叠,但不进入细胞核;在BMSCs与CDs共培养9天后,仍能在激光共聚焦显微镜下看到荧光;在4℃低温培养下的BMSCs摄取CDs的量明显降低（P<0.05）;ALP活性检测结果显示,CDs组细胞的ALP活性高于空白对照组（P<0.05）;茜素红染色结果表明CDs组细胞外基质矿化水平高于对照组;在RT-PCR结果中CDs组的成骨相关基因OPN、OCN、Runx2、Osterix的相对表达量高于对照组（P<0.05）。结论:CDs具有良好的生物安全性,具有示踪BMSCs,并促进SD大鼠BMSCs成骨分化功能的潜力。
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