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近半个世纪来，肺癌发病率和死亡率呈持续上升趋势，肺癌死亡率的高低对整个恶性肿瘤的预后举足轻重，因此加强对肺癌诊断的研究尤为重要。目前临床上多以细胞角蛋白21-1片段（CYFRA21-1）、癌胚抗原（CEA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）等肿瘤标志物作为肺癌诊断的辅助检查手段，其对肺癌的灵敏度一般在30-70％之间，此三项肿瘤标志物单项检测均有一定的局限性，联检是否能提高灵敏度报道较少。 肺癌诊断直接影响着肺癌治疗措施的制定，其中远处转移是个关键因素，这使得检测肺癌血源性微转移成为一研究热点。近来随着分子生物学技术的发展，逆转录多聚酶链反应法（RT-PCR）通过快速筛检循环癌细胞来判断是否存在血源性微转移，目前多以细胞角蛋白19（CK19）作为检测上皮性实体癌血源性微转移的靶基因，CK19 mRNA在肺癌组织中有表达已有定论，但其在血细胞中有无表达尚有争论。 为探讨CK19 mRNA是否能作为检测肺癌血源性微转移的靶基因，本研究检测了67例肺癌和30例肺良性疾病（BLD）患者外周血中CK19 mRNA的表达，结果提示肺癌组外周血 CK19 mRNA阳性率显著高于 BLD组。血清CYFRAZI－l＋CEA或CYFRAZI－l＋NSE h项联检能提高对肺癌的灵敏度。 l 病人和方法1＊ 病人：1．1刁病例组为肺癌初诊病人67例，所有病例均经手术或穿刺病理确诊，鳞癌25例，腺癌28例，小细胞肺癌（SCLC）14例。分期根据国际抗癌联盟1997年TNM分期，I期8例，11期15例，Ill期27例，IV期17例。1．1．2对照组为BLD病人30例，肺炎16例，慢性支气管炎4例，肺脓疡1例经临床治疗均排除恶性病变，肺结核2例及肺良性腺瘤7例均经病理确诊。l．2标本采集和 RNA的抽提：第一管静脉血 Zml用于血清 CYFRAZll、CEA、NSE检测。第二管血sml以肝素抗凝，分离出外周血单个有核细胞（PBMCS），Trizol试剂盒抽提总 mRNA，并溶解于 10pl DEPC无菌水。1．3 RT－PCR1．3j RT W系共 20ul，包括 RNA，sx M－MLV RT buffer，0·IM DTT，10mMdNTP，Rnasin，弓物 oligo dT，M－MLV RT，DEPC无菌水，37oC水浴 1J时。设立DEPC无菌水阴性对照组。1．3．2 PCR CK19及卜actin PCR体系共 25PI，包括 cDNA，10x PCR buffer，25mMMgCI。，10mM dNTP，Taq DNA聚合酶，上游引物，下游引物，DEPC无菌水。扩增条件为95 C变性5分钟，再经过40个循环即95C变性1分钟，54oC退火 1分钟，72℃延伸 1，5分钟，最后在 72oC延伸 10分钟，置于 4℃。同时设 2了DEPC无菌水阴性对照组。1．3．3取PCR产物10pl琼脂糖凝胶电泳，紫外荧光数字成像仪观察，CK19mRNA表达阳性者在460hp处有条带出现，在370hp处出现的条带为6咆ctin产物。1．4血清 CYFRAZI－l，CEA，NSE测定 一 血清CYFRAZI－1用酶联免疫吸附法测定，＞3．3ng／thl为阳性。CEA用时间分辨荧光法测定，＞sng／ml为阳性。NSE用酶联兔疫吸附法测定，＞13ng／ml为阳性。1．S统计方法：用SSPS10．0统计软件包进行分析处理。2结果2、l肺癌组 CK19 mRNA阳性率为 57．6％，对照组为 33，3O，两组比较有显著差异（P＜0．05）。对照组中，男与女之间或吸烟者与不吸烟者之间 CK19 mRNA阳性率无显著差异，CK19 mRNA阳性组与阴性组病人平均年龄无显著差异。2．2肺癌组中鳞癌 CK19 mRNA阳性率为 60．0％，腺癌为 50．0％，非小细胞肺癌（NSqLC）为 54厂％，SCLC为 64．3％，各组织类型间 CK19 mRNA阳性率比较无显著差异（P＞0．05）。2．3肺癌 1＋11期 CK19 mRNA阳性率为 30．4O，Ill、W期分别为 70．4％及 70．6％，Ill、IV期CK19 mANA阳性率显著高于1八期（P＜0．of）。2，4肺癌组与BLD组CYFRAZI－l、CEA、NSE浓度水平比较有显著差异。2．5 NSCLC血清 CYFRAZI－l、CEA水平及阳性率显著高于 SCLC，鳞癌CYFRAZI－l、腺癌 CEA、SCLC NSE水平及阳性率显著高于其他类型。26 Ill、N期肺癌 CYFRAZI－l。CEA、NSE水平及阳性率显著高于 1＋11期。 327 CYFRA21刁＋CEA或CYFRAZll＋NSE二项联检对肺癌的灵敏度从单项的28．4－52．20提升到70．lO，显著高于单项检测（P＜0．05），特异性无明显下降 （Ptoo．05）。三项联检的灵敏度从二项联检的70＊％提升到79．l％，并不显著高于二项联检（P＞0．05）。四项联检灵敏度显著高于二项联检，特异性亦明显下降（P＜0．05）。NSCLC中，CYFRA21－l＋CEA联检的灵敏度从单项的 20．7 一 60．4O升至 79．2％，显著高于单项检测（P＜0．05），特异性无明显下降（PTh0．05）；sCLC中，二项及三项联检灵敏度并不显著高于NsE单项检测（P＞0刀5）。3．结论3刁 以 CK mRNA为靶基因的 RT．PCR法能检测出肺癌外周血中 CKmRNA的表达，可作为检测肺癌血源性微转移的靶基因，但特异性不够高?