海藻糖的合成由海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）共同催化完成,海藻糖-6-磷酸合成酶是该反应的限速酶。将大肠杆菌和酵母菌海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）与海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）的融合基因,导入烟草、马铃薯、水稻和拟兰芥中获得的转基因植株,耐旱等非生物逆境抗性提高。但是,过量表达大肠杆菌和酵母菌TPS基因的转基因植株生长出现畸形等表型,而过量表达植物内源TPS因的转基因植株却没有出现这些表型。这些现象揭示了植物来源的TPS因相对于大肠杆菌和酵母菌TPS基因而言,在转基因研究中具有更加广阔的运用前景。 在蕨类植物中,卷柏科一些旱生种在干旱条件下体内海藻糖含量可高达20%。美国科学家从复活卷柏克隆海藻糖-6-磷酸合成酶基因SlTPS1,并申请专利保护。然而植物来源的TPS基因其蛋白的酶活力比较低,在酵母中表达也只能检测到很少的海藻糖积累。通过序列比对发现植物来源的TPS相对大肠杆菌和酵母菌在其N-端有儿十个氨基酸残基的冗余序列,截去N-端冗余序列能够显著提高TPS的催化活性。本课题组通过同源扩增的方法,从垫状卷柏中克隆出海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长序列,命名为SpTPS1,申请获准专利保护。 本研究通过对垫状卷柏（Selaginella pulvinata, SpTPS1）、复活卷柏（Selaginellalepidophylla, SlTPS1）、玉米（Maize, ZmTPS1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana, AtTPS1）、水稻（Oryzasativa, OsTPSI）、酵母（Saccharomyces cerevisiae, ScTPSl）、小麦（Triticum aestivum, TaTPS1）和大肠杆菌（E coli, OtsA）8个物种TPS基因的氨基酸序列进行比对,发现垫状卷柏SpTPS1基因所编码蛋白的氨基酸序列的N-端有75个氨基酸的冗余序列。因此,我们设计相应引物,采用PCR扩增的方法对其进行截短修饰改造,并构建酵母表达载体,转化酵母TPS1突变体,验证截短后TPS基因生物学功能,比较全长基因序列和截短后基因序列编码TPS的催化活性。研究结果如下： （1）成功克隆了2970bp全长基因（SpTPS1）和截短225bp的修饰基因（SpTPS1Δ）; （2）通过酵母异源功能互补实验证明,SpTPS1和SpTPS1Δ基因编码的蛋白都具有海藻糖-6-磷酸合成酶功能； （3）酶活测定显示,截短修饰基因编码蛋白的酶活性是全长基因编码蛋白酶活性的6倍,而热激处理测定细胞体内海藻糖含量,截短修饰的基因细胞内海藻糖含量相对于全长基因提高了8%。用截短修饰后的海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1Δ转化玉米等作物,对干旱等非生物逆境抗性的改良作用可能更为明显。