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目的:在建立激素性股骨头坏死动物模型的基础上,从组织形态学及细胞分子的水平,研究维生素E对于激素性股骨头坏死早期骨细胞凋亡、骨髓造血细胞DNA氧化损伤的影响及不同剂量维生素E对激素性股骨头坏死细胞凋亡的影响,探讨维生素E干预激素性股骨头坏死的作用及相关机制,为临床预防及治疗激素型股骨头坏死提供相关思路。方法:维生素E对激素性股骨头坏死早期骨细胞凋亡、骨髓造血细胞DNA氧化损伤的影响1.选健康中国大耳白兔36只,随机将其分为3组。模型组(model group),12只,耳缘静脉内注射10μg/Kg脂多糖,24h后于右侧臀肌注射20mg/Kg甲基强的松龙,总共3次,每次间隔24小时。维生素E组(vitamin E group),12只,耳缘静脉内注射10μg/Kg脂多糖,24h后于右侧臀肌注射20mg/Kg甲基强的松龙,总共3次,每次间隔24小时。于造模开始之日饲予维生素E,0.6g/Kg/d。对照组(control group):同前两组在相同时间点用同样的方法注射等量的生理盐水。每组实验动物均肌内注青霉素,剂量80万u/只,每周两次,以预防感染。观察各组动物的一般状况(如精神状态、食欲情况、体重变化等),制模完成后4周和6周,采用空气栓塞法各组分别处死6只,在相对无菌条件下取双侧股骨头常规固定脱钙、包埋,切片待测。2.在显微镜下对各组标本行组织形态学观察,苏木精—伊红染色(HE)光镜下计数空缺骨陷窝。3.采用原位末端转移酶标记(TUNEL)染色法分析各组股骨头组织中骨细胞凋亡情况,计数凋亡指数。4.采用免疫组织化学链菌素抗生物素蛋白一过氧化物酶(SP)法检测各组股骨头组织第4周凋亡基因相关蛋白bcl-2、bax和caspase-3的表达;并采用实时荧光定量PCR(Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)法分析3组兔股骨头组织中bcl-2、bax和caspase-3 m RNA水平;5.利用免疫组织化学法检测各组标本第4周骨髓造血细胞DNA氧化损伤。不同剂量维生素E对激素性股骨头坏死早期骨细胞凋亡的影响1.动物75只,分为5组,模型组,15只,造模方法同上。维生素E组,共45只,分为高剂量组(high-dose group of vit E)(1.2g/Kg/天)、中剂量组(middle-dose group of vit E)(0.6g/Kg/天)、低剂量组(low-dose group of vit E)(0.3g/Kg/天)剂量组,每组15只,同模型组方法造模。并于造模开始之日饲以不同剂量的维生素E。对照组,15只,于相同时间点注射等量的生理盐水。观察各组实验动物的一般状况,制模完成后4周、6周和8周,分批取材。2.行组织形态学观察及HE染色光镜下计数各组空缺骨陷窝。3.采用TUNEL法检测各组骨细胞凋亡情况,计数凋亡指数。结果:1.组织病理学观察(HE)模型组:骨小梁结构紊乱、稀疏变细、骨细胞大量减少,空骨陷窝增加;维生素E组:中、低剂量组:骨小梁结构欠规则,排列较稀疏,杂乱。空骨陷窝较多。高剂量组:骨小梁结构基本完整,可见少许空骨陷窝。对照组骨小梁结构完整,排列致密有序,成骨细胞核大且位于中央。模型组的空骨陷窝率均高于维生素E组(P<0.05),模型组及维生素E组的空骨陷窝率均高于对照组(P<0.05);维生素E高剂量组的空骨陷窝率均低于中、低剂量组(P<0.05)。2.细胞凋亡检测(TUNEL)模型组的骨细胞凋亡指数均高于维生素E组(P<0.05),模型组及维生素E组的骨细胞凋亡指数均高于对照组(P<0.05);维生素E高剂量组的骨细胞凋亡指数均低于中、低剂量组(P<0.05)。3.免疫组织化学法检测结果制模后4周,模型组bcl-2阳性细胞率减少,bax、caspase-3阳性细胞率增加,与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。维生素E组bcl-2阳性细胞率较模型组增加,低于对照组(P<0.05),bax、caspase-3阳性细胞率较激素模型组减少,高于对照组(P<0.05)。4.骨髓造血细胞DNA氧化损伤结果制模后第4周时,维生素E组骨髓造血细胞DNA氧化损伤率低于模型组,高于对照组(P<0.05)。5.PCR结果第4周取材时,与维生素E组比较,模型组股骨头组织中bcl-2m RNA水平下降(P<0.05),bax和caspase-3 m RNA和蛋白质水平升高(P<0.05)。模型组、维生素E组与对照组相比,标本中bax和caspase-3m RNA和蛋白质水平明显升高,而bcl-2 m RNA和蛋白质水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。6.维生素E各组之间比较,高剂量组在改善骨细胞凋亡方面差异显著(P<0.05)。结论1.在激素性股骨头坏死早期,大剂量激素可能通过抑制bcl-2的表达,促进bax及caspase-3的表达而导致股骨头发生缺血坏死。2.维生素E可能通过相反的途径影响骨细胞凋亡,可能通过促进bcl-2的表达和抑制caspase-3和bax的表达来抑制骨细胞凋亡。3.维生素E可减轻激素性股骨头坏死早期骨髓造血细胞DNA氧化损伤,可为预防早期激素性股骨头坏死提供新的方法。4.高剂量维生素E可以有效地改善激素性股骨头坏死的骨细胞凋亡。