[研究背景]现代社会,越来越多的育龄期夫妇面对不孕不育问题的困扰,这些不孕不育夫妻中约40%是男方由因素引起,其中50%的不育男性精子畸形率表现异常,且这一比例有上升的趋势。男方精液质量异常也越发成为导致不育的重要因素。自1992年ICSI(卵母细胞浆内单精子注射)技术成功使因男性因素导致的不孕不育夫妇获得妊娠以来,众多因男方精液质量异常的不孕不育夫妇获得了较满意的助孕结局。ICSI的常规适应症为：1、严重的少、弱、畸精子症(严重少精子症：一次射精的活精子浓度<1×106/ml；少弱畸精子症：精子浓度<20×106/m1,同时a+b级运动精子<20%和／或精子形态异常率>85%；弱畸精子症：精子浓度>20×106/ml,正常形态精子<10%,同时a+b级运动精子<50%；(此标准为按照第四版《WHO人类精液检查与实验室处理手册》提供的正常精液参考值评定)；2、两次以上不明原因IVF-ET受精失败或受精率低于30%；3、卵母细胞体外成熟治疗周期；需行植入前胚胎遗传学检查者；4、射精异常者；5、由各原因引起的不可逆性的梗阻性无精子症；6、非梗阻性无精子症,如生精功能障碍导致的无精子症等。ICSI的受精率高达70%,在很大成都上提高了精子质量较差患者的受精率,成为人类辅助生殖发展史上的第二场革命,解决了部分不育男性的生育问题。精子形态与精子功能密切相关,精子形态学分析结果被认为是对自然怀孕、IUI(宫腔内人工授精)、IVF成功受孕率最有预测性的指标。在常规ICSI中,操作者通常采用低倍镜(×200-400)对精子头部、颈部、尾部进行形态学观察、挑选,然而,在该放大倍数下往往只能对精子进行较为笼统的观察,一些细微的精子形态结构异常常无发被观察到,可能会有一些超微结构异常的精子越过自然选择的屏障,被人为地注射入卵母细胞,最终导致早期胚胎分裂发育阻滞。这些可能是导致ICSI治疗周期失败的原因之一。近年来,很多学者致力于挑选精子技术的研究,试图通过更高倍数的放大系统观察精子的细微结构,并探讨精子细微形态结构异常与其内部生理功能异常的关系,其中影响最为广泛的为Bartoov在2001年提出的MSOME(活精子细胞器形态学检测)技术,以及将MSOME技术与传统ICSI相结合而来的IMSI(精子形态选择性胞浆内单精子注射)技术,IMSI技术将在更高放大倍数(×6600-×13000)下对精子头部、顶体、顶体后区、颈部、线粒体、尾部这6个细胞器进行实时的、精确的观察,最终挑选到有活力且细微形态结构正常的精子,注射入卵母细胞。其中精子头部是否含空泡以及空泡的大小是判断精子形态正常与否的关键指标。对于IMSI的具体适应指征方面,目前有许多相关报道指出,对于多次ICSI治疗周期失败的患者,应用IMSI技术能够获得较高的种植率、临床妊娠率,降低流产率。除了反复ICSI失败的患者,也有研究指出,IMSI能提高畸精子症患者的种植率、临床妊娠率。有研究将IMSI技术应用于圆头精子症的患者,挑选出形态正常的精子注射入卵母细胞,最终获得成功分娩。Knez等学者在IMSI技术对胚胎发育影响的研究中指出：IMSI能显著提高治疗周期的囊胚形成率。然而,也有一些报道指出IMSI技术不并不能改善助孕结局。因此,IMSI对于不育患者的治疗效果及其主要的适应症仍未明确。与此同时,MSOME放大系统下观察到的精子细微形态结构异常与其内部病理生理学的关系,也成为许多学者研究的焦点,其中,被研究最为广泛的是：精子空泡与高DNA碎片发生率的相关性;然而,染色质凝集异常、染色体结构异常、高的非整倍体发生率等这些遗传物质异常也可能与精子细微结构异常存在相关性,这些细微结构的异常是否与精子遗传物质的稳定性相关,以及是否会通过ICSI操作影响受精过程及后续胚胎的发育,这些问题并没有得到深入研究。因此,IMSI技术是否能够改善不育患者的治疗结局、能够显著改善哪一类患者的助孕结局,以及经过挑选后的精子可能是通过哪些机制来改善助孕结局等问题需要我们进行进一步研究分析。[目的]1、使用活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统系统对不育男性患者的精子进行形态选择性卵母细胞浆内单精子注射术(IMSI),观察IMSI技术能否改善因男性精液问题而不孕不育夫妇的助孕结局。2、使用活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统对不育患者的精液样本进行形态学分析,定义新的MSOME系统参数,分析这些MSOME参数与传统常规精液参数及卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)周期助孕结局之间的关系,最终确立一个最有意义的MSOME参数并探讨其对不育患者的诊断价值及ICSI周期助孕结局的预测价值。3、通过MALBAC单细胞全基因组扩增技术结合二代测序的方法(CNV-Seq)对活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统下挑选的不同形态的单个精子进行染色体核型的分析,探讨MSOME系统下观察到的精子形态异常与染色体核型异常的相关性从而发掘MSOME系统该善ICSI患者助孕结局的相关机制。[研究方法]1、回顾分析四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心2013年1月至2014年11月共82例梗阻性无精子症患者,将行TESA(经皮睾丸穿刺抽吸精子术)获得的睾丸精子通过放大系统(×6600)挑选后行卵母细胞注射(IMSI组),2013年1月至2014年11月共91例梗阻性无精子症患者经TESA取精术后行常规卵母细胞浆内单精子注射(ICSI组);2014年1月至11月共44例畸精子症患者行形态选择性包浆内单精子注射治疗(IMSI组),2014年1月至11月共71例畸精子症患者行常规ICSI治疗(ICSI组)。统计分析ICSI组和IMSI组患者的实验室结局和临床结局。2、选取50例在四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心进行ICSI治疗的少、弱、畸精子症患者,将每位患者的精液样本分成两份,一份进行常规精液分析；另一份精液样本经过预处理后首先在常规ICSI周期低倍镜下(×400)挑选出形态正常的活精子30个,随后使用MSOME放大系统,在高倍镜(×6600)下对经过低倍镜挑选出的活精子进行细胞器形态学检测分析,并统计相关MSOME参数(二次挑选后的MSOME正常形态精子率、MSOME头部大空泡精子率),将MSOME参数与常规精液参数、男方年龄、受精率、优质胚胎率、囊胚形成率进行相关分析。将MSOME参数、女方年龄、不孕年限、男方常规精液参数等对助孕结局的影响采用Logistic回归分析,并用受试者工作曲线(ROC)对回归模型进行分析。若Logistic回归方程提示存在MSOME参数对妊娠结局的影响有统计学意义,则运用受试者工作曲线(ROC)分析该MSOME参数对ICSI周期助孕结局的预测价值,并最终确定一个MSOME参数临界值用来预测ICSI周期患者的助孕结局。3、选取3例于2015年5月-2015年12月在四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心进行ICSI治疗的重度少弱畸精子症患者,于取卵日当天嘱患者手淫方式排精,将每位患者的精液样本分成两份,一份进行常规精液分析；另一份精液样本经过预处理后在MSOEM放大系统(×6600)下进行观察挑选,每份样本中挑选10条形态正常的活动精子以及20条头部存在大空泡(空泡面积>4%头部面积)的活动精子。接着对每条精子进行单精子全基因组扩增(WGA)在平均>0.02x深度下进行全基因组拷贝数变异分析CNV-Seq,从而发现非整倍体、染色体大片段增加或缺失、非平衡易位等染色体核型异常。[结果]1、梗阻性无精子症患者中正常受精率IMSI组显著高于ICSI组(84.3% vs 77.0%) (P<0.05); ICSI组的卵裂率95.5%,优胚率28.2%,囊胚形成率54.8%,种植率26.4%,临床妊娠率47.3%,流产率14%,梗阻性无精子症IMSI组患者的卵裂率96.7%,优胚率29.2%,囊胚形成率54.3%,种植率32.3%,临床妊娠率50.0%,流产率7.3%,两组无显著性差异(P>0.05)。畸精子症患者的正常受精率IMSI组显著高于ICSI组(68% vs 75.5%)(P<0.05),囊胚形成率IMSI组显著高于ICSI组(54.6% vs 67.9%) (P<0.05), ICSI组的卵裂率96.2%,优胚率27.6%,种植率28.2%,临床妊娠率43.7%,流产率9.7%; IMSI组患者的卵裂率95.2%,优胚率27.1%,种植率30.7%,临床妊娠率43.2%,流产率10.5%,两组无显著性差异(P>0.05)。2、两个MSOEM参数均与常规精液参数中的正常精子百分比及囊胚形成率存在相关性(p<0.05)。二次挑选后的MSOME正常形态精子率与正常精子百分比、囊胚形成率呈正相关(R=0.670, P=0.000; R=0.513, P=0.000),与其他常规精液参数、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3优胚率、囊胚形成率无相关性(p>0.05);二次挑选后MSOME头部大空泡精子率与正常精子百分比、囊胚形成率呈负相关(R=-0.566, P=0.000; R=-0.356, P=0.003),与其他常规精液参数、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3优胚率、囊胚形成率无相关性(p>0.05)。二次挑选后MSOME头部大空泡精子率、a级精子比、a+b级精子比对生化妊娠的影响有统计学意义(p<0.05)；另一MSOME参数(二次挑选后的MSOME正常形态精子率)及其他因素对生化妊娠的影响无统计学意义(p>0.05)；多因素Logistic回归模型对生化妊娠结局有预测价值(ROC曲线下面积为0.890,敏感度为90.91%,特异性为84.6%)；MSOME参数(二次挑选后MSOME头部大空泡精子率)对生化妊娠结局有预测价值(ROC曲线下面积为0.828),同时分析得到一个最佳临界值56.2%(敏感度为86.96%,特异性为69.23%),将56.2%作为平均MSOME头部大空泡精子率的临界值,根据这一取值对50例纳入研究的患者进行分组(A组n=35、B组n=15),结果显示：A、B两组在卵裂率(98.0%vs 91.5%)、生化妊娠率(61.8% vs 7.1%)、种植率(81.0% vs 0)上有显著性差异(p<0.05)；受精率、囊胚形成率、D3优胚率无显著性差异(p>0.05)。3、3名重度少弱畸精子症患者共36条单精子,其中24条含空泡精子中检测出染色体核型异常精子14条,多条常染色体缺失或增加精子12条,染色体大片段缺失或增加的精子1条,出现XX/XY/YY二体畸形的精子4条；12条形态正常精子中检测出染色体核型异常精子5条,其中多条常染色体缺失或增加精子5条,染色体大片段缺失或增加的精子0条,出现XX/XY/YY二体畸形的精子1条。[结论]1、梗阻性无精子症患者的睾丸精子经放大系统选择后行ICSI,正常受精率较传统ICSI有显著性提高；畸精子症患者射出的精液标本经放大系统挑选后行ICSI,正常受精率、囊胚形成率较传统ICSI有显著性提高。2、两个MSOME参数均与精子常规参数中的正常精子百分比具有相关性,而且都影响ICSI周期中的后期胚胎发育情况；二次挑选后MSOME头部大空泡精子率、a级精子比、a+b级精子这三项影响因素比对生化妊娠结局的影响有统计学意义；且MSOME参数综合其他相关影响因素对预测ICSI治疗周期的妊娠结局有一定的临床意义；在本研究中我们确立了一个MSOME参数(二次挑选后MSOME头部大空泡精子率)的临界值,同时证明了这一参数与ICSI妊娠结局的关系,这一MSOME参数(二次挑选后MSOME头部大空泡精子率)可作为独立因素用来预测ICSI治疗周期的妊娠结局。3、本实验证实MSOME系统观察的头部含大空泡精子(>4%头部体积)与正常形态精子的非整倍体发生率无显著性差异,但较后者有上升趋势,这可能是由于纳入本次实验的单精子数量有限导致。MSOME系统可降低挑选到染色体核型异常的精子,这可能是前期试验中证实的IMSI技术可提高畸精子症患者助孕结局的潜在机制。