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本课题组研究发现,玉米大斑病菌HOG-MAPK级联途径中HOG1基因敲除突变体对高渗胁迫的耐受性下降,部分原因是突变体菌丝积累甘油能力下降。ΔStHOG1对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性大大增强,显微镜观察发现,突变体细胞壁外侧絮状物质消失,细胞壁变得光滑,推测HOG1基因突变影响了菌丝细胞壁的发育,但是细胞壁的这种变化与病菌对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质耐受性增强是否有关尚不清楚。研究证实HOG1可以磷酸化Sko1,Hot1,Smp1,Msn1,Msn2,Msn4等转录因子,这些转录因子如何调节靶基因的表达尚不清楚。本课题组研究发现,玉米大斑病菌中仅存在一个Msn2的同源蛋白,命名为StMsn2;研究表明,酵母菌MSN2和MSN4双突变体对高渗胁迫的耐受性大大下降,稻瘟病菌MSN2基因敲除突变体不再产生分生孢子,丧失对水稻叶片的致病能力。由此可见Msn2蛋白很可能参与了真菌HOG-MAPK级联途径对高渗胁迫的适应及细胞壁发育和致病性的调控。但是Msn2蛋白是否参与真菌对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性调控尚不清楚。在此基础上,我们利用农杆菌介导的转化技术,获得了2株玉米大斑病菌StMSN2基因敲除突变体;并对该突变体的生长发育,对高渗胁迫的耐受性,对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性及病菌的致病性进行了研究。主要研究结果如下:1.获得了2株StMSN2基因敲除突变体。以pBS-PUC及pPZP100载体为基本骨架、潮霉素抗性基因(HPH)作为筛选标记,成功构建了玉米大斑病菌StMSN2基因敲除载体。利用农杆菌介导的ATMT转化技术,转化玉米大斑病菌01-23的野生型菌株,然后经过潮霉素抗性筛选、特异引物PCR、RT-PCR、southern blotting验证,最终得到2株StMSN2基因敲除突变体,将其命名为ΔStMSN2-1、ΔStMSN2-2。2.StMSN2基因突变影响了病菌的生长发育及致病性。2株ΔStMSN2-1,ΔStMSN2-2基因敲除突变体在PDA培养上菌落生长速率较野生型增大,菌落颜色变浅,突变体不再产生分生孢子。光学显微镜观察发现:突变体菌丝细胞较野生型明显变长,大约是野生型细胞长度的3.2倍,突变体菌丝较野生型黑色素含量显著下降。StMSN2基因缺失使突变体菌丝分化出附着胞的时间大大延迟,且不能穿透玻璃纸膜,不能侵染完整的玉米叶片,但是,仍然可以侵染表皮受到划伤的玉米叶片。3.StMSN2基因突变增强了病菌对细胞壁合成干扰物质的耐受性,同时降低了病菌细胞壁对胞壁裂解酶的抗性。(1)在CFW和刚果红等细胞壁合成干扰物质处理条件下,突变体菌落生长受抑制程度显著低于野生型;(2)在细胞壁降解酶的作用下ΔStMSN2产生的原生质体数量是野生型的1.56倍。4.StMSN2基因突变降低了病菌对高渗胁迫的耐受性。高渗胁迫对野生型菌落生长抑制程度显著高于突变体。0.6 M山梨醇对ΔStMSN2-1、ΔStMSN2-2与野生型菌株的生长受抑制程度分别为对照的59.6%、60.6%和11.6%;0.4 M NaCl对其生长受抑制程度分别为对照的49.2%、57.5%和30.1%,0.4 M KCl对其生长抑制程度分别为对照的51.2%、53.0%和40.1%。5.StMSN2基因敲除突变体对咯菌腈和异菌脲的耐受性没有明显变化,而StHOG1基因敲除突变体对咯菌腈和异菌脲的耐受性显著增强。在35μg/mL异菌脲处理下,WT菌株、StMSN2基因敲除突变体和StHOG1基因敲除突变体的菌落生长受抑制程度分别为对照的100%、100%、100%、7%。在0.75μg/mL咯菌腈处理下,WT菌株、两株StMSN2基因敲除突变体和StHOG1基因敲除突变体的菌落生长受抑制程度分别为对照的80%、82%、77%、9%。