研究背景和目的艰难梭菌(Clostridium difficile)是院内获得性腹泻和伪膜性肠炎的首要原因。过去20年中,院内及社区艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的发生率和死亡率均显著上升,其临床表现多样,包括无症状携带、轻至中度腹泻和危及生命的中毒性巨结肠。广泛的疾病谱受患者因素如年龄、基础疾病、免疫状态及肠道微生物等多因素影响,此外,菌株之间的产毒能力差异也是影响CDI临床表型的重要因素,但其与CDI严重程度的关系尚不明确。产毒菌株主要通过产生大分子毒素蛋白A(TcdA)和B(TcdB)引起相关临床症状。在动物模型实验中,TcdA和TcdB均可独立致病。大多数产毒菌株同时产生TcdA和TcdB(A+B+),TcdA表达缺失的A-B+菌株也能够引起临床疾病。相反,TcdB表达缺失的A+B-菌株鲜有报道,其致病性尚缺乏流行病学及实验数据支持,导致长期以来临床上均将TcdB作为诊断及治疗的靶点。但TcdB单抗治疗并不能完全缓解症状,使我们重新审视TcdA在CDI致病过程中的重要性。国内外研究中均发现调节肠道微生态有助于防治CDI,健康的肠道微生物群在宿主抵抗病原体的防御机制中起着关键作用,称为定植抗性(colonization resistance)。其直接机制包括直接杀伤病原体(噬菌体、6型分泌系统、细菌素等)、分泌代谢产物(短链脂肪酸、次级胆汁酸等)抑制病原菌生长等;间接机制包括竞争有限的营养和空间、增强免疫应答(3型天然淋巴细胞、Th17、IgA及IgG抗体)等。除了直接与艰难梭菌作用,研究发现感染A+B+菌株的患者比A-B+菌株的患者粪便细菌多样性降低程度更大,且伴有肠球菌丰度异常增高,表明TcdA/B可能对肠道参与艰难梭菌定植抵抗的微生物群有不同程度的直接影响;肠道菌群可能通过与毒素蛋白直接作用抑制CDI,维护肠道菌群稳态。本研究拟通过对中国南方地区艰难梭菌临床菌株的分离鉴定,调查艰难梭菌毒素基因表达和突变情况;拟通过测定临床CDI患者及无症状携带者粪便TcdA/B浓度,分析TcdA在CDI致病过程中的重要性;并探讨毒素TcdA/B与肠道共生菌的相互作用及机制。本研究期望获得有临床指导价值的艰难梭菌毒素相关基因突变位点,为我国建立合适的分子生物学检测方法提供参考毒素基因序列,为CDI引起的复杂临床表现提供基因水平的支持证据;在TcdA/B毒素蛋白水平提供临床检测依据;同时为肠道共生菌的定植抵抗机制提供新的思路,为CDI的新型非抗生素预防及治疗策略开辟道路。研究方法1.共计复苏100株艰难梭菌,提取基因组DNA,设计特异性引物通过PCR扩增tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE及cdtA、ctdB毒素基因并测序,并挑选突变位点不同的4株分离菌进行全基因组测序验证。对年龄、性别、住院时间、血常规、生化检查、内镜及病理结果等各项参数进行回顾性分析,联合分析序列突变热点和临床病人资料,采用SPSS19.0软件分析数据,P值<0.05为有统计学意义。另外83株艰难梭菌被用于验证性研究。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定不同菌株上清液对NCM460的细胞毒作用。采用Western blot检测不同菌株上清液对Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1和occludin的影响。选取HUVEC细胞构建单层血管内皮细胞模型,加入不同菌株培养上清刺激24小时,测量跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)评估内皮功能的损伤程度。这些菌株也在CDI小鼠模型中进行了体内试验,HE染色观察结肠病理表现,改性MSB纤维素染色法观察结肠纤维素渗出程度。2.收集BIDMC 187例CDI患者和44例携带者的粪便样本。从粪便中培养分离艰难梭菌,PCR检测是否存在tcdA/B基因。通过培养和细胞毒性试验(CTA)评估每个分离菌株的体外毒素产生/活性;选取部分代表性菌株在CDI小鼠模型的体内进行了测试。采用Simoa法测定TcdA和TcdB的浓度。3.通过生物信息学分析TcdA及TcdB蛋白序列,使用FPLC系统纯化TcdA及TcdB毒素蛋白,标记Alexa-555荧光分子,使用流式细胞术检测其与小鼠肠道菌群的结合,同时使用Alexa-488-小麦胚芽凝集素(WGA)选择性标记革兰阳性菌。分析可能结合的细胞壁成份-脂磷壁酸(LTA),利用LTA表达缺失突变金黄色葡萄球菌验证其功能;使用流式细胞术检测LTA是否可与肠道菌群竞争结合TcdA;并通过细胞毒实验、CDI小鼠模型及Loop模型,评估肠道微生物介导的LTA在CDI中的预防及保护作用。研究结果1.共计成功测序53株艰难梭菌,其中毒素基因型A+B+50株,94.3%;A-B+3株,5.7%;cdtA ctdB均为阴性。明显发现了5个毒素基因的突变位点及序列存在高度连锁相关性,当tcdA检测不到时,tcdR的突变不参与其他毒素基因的“连锁”。全基因组测序与第一代测序结果高度一致,15株存在一定的基因序列替代,38株不存在任何突变。在GO生物通路数据库中进行功能富集分析,我们发现生物通路中的差异靶基因主要表现在多种代谢过程、单分子转运、基因表达等方面。在基因产物的分子功能上,主要集中于多种酶的催化活性;细胞成分、膜结构也有显著差异。通过对KEGGpathway数据库的富集分析,发现了5个不同基因显著富集的相关通路,2个与葡萄糖代谢相关的通路,1个与同型半胱氨酸代谢相关的通路,1个与转运相关的通路,1个与鞭毛虫组装相关的通路。回顾性分析53例患者的临床资料,两组患者在性别、年龄、住院时间、血清肌酐、尿素氮、白蛋白、血糖、血脂、患者基本情况等方面差异均无统计学差异(P>0.05),而基因“连锁突变”菌株感染患者肠道伪膜的发生率(P<0.001)、中性粒细胞百分比(P<0.05)显著高于非突变菌株。艰难梭菌突变菌株在体内外实验中均表现出较高的毒性。艰难梭菌突变体上清培养24小时后,Caco-2细胞中肠道紧密连接蛋白Zo-1和Occludin表达下调。添加艰难梭菌突变体上清液后的HUVEC细胞TEER值明显低于未突变菌株(P<0.05)。结肠病理染色表明突变株感染小鼠肠道炎症较重,纤维素渗出明显增多。2.本研究共纳入187例CDI患者和44例无症状携带者,在其中8例CDI患者和6例携带者的粪便发现TcdA浓度(23-17422 pg/mL)明显高于TcdB(<20 pg/mL),TcdA/TcdB中位比值17.93(6.3～1914.5)。13个分离株均具携带tcdA和tcdB基因,体外培养上清液(72h)中TcdA的浓度远远超过TcdB(TcdA/B中位比值26,11.1～3577.6),CTA均为阳性。选取8株TcdA?B菌株感染小鼠,其实4株引起腹泻,3株致死。BID-71菌株感染小鼠CDI盲肠内容物毒素浓度测定,TcdA>200,000 pg/mL,～100 pg/mL TcdB。3.TcdA和TcdB蛋白含有多个细胞壁结合重复序列,0.5μ/mL TcdA和TcdB可结合超过70%小鼠肠道内的革兰氏阳性细菌。LTA表达缺失的金黄色葡萄球菌与TcdA的结合率明显降低。LTA以剂量依赖性的方式抑制TcdA和TcdB对3T3细胞的毒性作用,10 μg/mL LTA完全抑制0.1μg/mL TcdA的毒性,100 ug/mL LTA完全抑制0.1μg/mL TcdB的毒性。LTA明显降低TcdA与小鼠肠道菌群的结合;Loop实验表明LTA可抑制TcdA的肠毒性。LTA预防性治疗(0.25 mg/mL)CDI小鼠存活率为70%,对照组为0%(P<0.0001);感染后LTA治疗(30mg/kg/d)也显示出保护的趋势,但无统计学意义。结论1.感染毒素基因“连锁突变”的艰难梭菌与临床伪膜性肠炎的发生高度相关。2.首次发现TcdA>>TcdB产毒艰难梭菌,表明TcdA在CDI发病机制中具有重要作用,对CDI的诊断、治疗和疫苗开发具有重要意义。3.肠道共生菌介导的LTA可通过中和艰难梭菌毒素参与CDI的定植抵抗。这项工作可能为CDI的新型、非抗生素、预防和治疗策略开辟道路。