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反式-4-羟基-L-脯氨酸（tr ans-4-hy droxy-L-pro line，Hydroxyproline，Hyp），是一种手性化合物，是重要的化合物前体，在药物、护肤及化工等方面皆有应用。γ-谷氨酸激酶(γ-glutamyl kinase，GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶(γ-glutamyl phosphate reductase，GPR)、二氢吡咯羧酸还原酶(△1-pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)、脯氨酸羟化酶proline4-hydroxylase(P4H)，是催化L-谷氨酸到L-羟脯氨酸合成途径的酶，分别由proB、proA、proC和p4h编码。本研究中，克隆了Bacillus Subtilis168、Klebsiella pneumoniae WM3、Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655、Corynebacterium glutamicum、Zymomonasmobilis ZM4 ATCC31821来源的proB、proA、proC基因，与人工合成优化的Dactylosporangium sp.strain RH1来源的p4h基因用重叠PCR的方法串联，基因间加入核糖体结合位点rbs，并通过无缝组装技术将线性化pET-28a质粒与串联基因连接，以E.coli BL21为宿主，构建得到五株菌E.coli BL21/pET-28a-BACHcg、E.coliBL21/pET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/pET-28a-HBACkp、E.coli BL21/pET-28a-HBACzm、E.coli BL21/pET-28a-HBAmg。重组菌以葡萄糖为底物，30℃摇瓶发酵培养24 h，Hyp产量达到最大。五株菌Hyp产量分别为0.33 g/L、0.61 g/L、0.46 g/L、0.28 g/L、0.55 g/L。