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白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害之一,每年造成严重的产量损失。而目前对白叶枯病的防治尚未有行之有效的措施,生产实践表明品种的遗传改良是控制该病害的最好途径。因此,挖掘和利用白叶枯病抗性基因资源并对栽培稻进行品种改良具有重要意义。
疣粒野生稻是我国现存的三种野生稻之一,是一种宝贵的栽培稻遗传改良种质资源基因库。它具有一系列栽培稻不具有的许多优良遗传性状,例如它对白叶枯病、稻瘟病、稻飞虱和纹枯病等病害的抗性等。由于它的染色体组为GG型,与栽培稻的染色体组AA型有很大差异,分属不同的种,以致很难克服二者之间有性杂交不亲和的障碍,难以把疣粒野生稻中的优良基因转移到栽培稻中。为了将来能通过体细胞非对称杂交法转移这些优良性状到栽培稻中,进行了疣粒野生稻与日本晴栽培稻的体细胞培养、原生质体培养及再分化研究,以及两种原生质体融合的初步研究。主要研究结果如下:
1.建立了良好的疣粒野生稻胚性悬浮细胞系,得到了疣粒野生稻的最佳悬浮培基:AA大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300 mg·L-1 CH+500 mg·L-1Pro+500 mg·L-1 Gln+2 mg·L-12、4-D+3.0%蔗糖。
2.以疣粒野生稻悬浮细胞为材料,建立了疣粒野生稻原生质体培养植株再生体系。系统地研究了影响原生质体分离、纯化、培养和植株再生的各种因素,得到了疣粒野生稻的最佳酶解体系:27.5℃黑暗条件下,2%纤维素酶+0.2%果胶酶+5 mmol·L-1 MES酶解4h,疣粒野生稻产量可达2.0×105个·g-1,而且活力在70%以上。原生质体用优化的培养基KM8p+2mg·L-12、4-D+0.2 mg·L-16-BA+500 mg·L-1 CH+100 mg·L-1Pro+10%葡萄糖,进行固液双层培养,疣粒野生稻原生质体植株再生率达6.2%。
3.首次采用UV对疣粒野生稻原生质体进行失活处理,发现随着紫外线剂量的增大疣粒野生稻原生质体愈伤诱导率及植株再生率都有一定程度的下降,但是影响不是很明显,大多数细胞仍能分裂;用2.5 mmol·L-1 IOA处理日本晴原生质体15 min失活效果最好。
4.利用PEG结合高pH-高钙诱导法获得了疣粒野生稻与日本晴对称性融合的稳定杂种细胞。最佳融合条件为:40%PEG(8000)+50 mmol·L-1 CaCl2·2H2OpH=10.5,融合30min,融合率为1.5%。
本文摸索建立的疣粒野生稻原生质体植株再生体系及疣粒野生稻与日本晴对称性融合的稳定杂种细胞的获得,为后续利用体细胞杂交技术转移疣粒野生稻优良性状和基因到栽培稻的研究打下了很好的基础。