人参亲环素pgCyP基因在拟南芥中的克隆表达及功能分析

来源 :长春中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yjc0208
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目的:研究人参亲环素pgCyP基因在抗人参疫病和高盐胁迫中发挥的作用,为人参抗病抗逆提供更多的选择。研究人参亲环素pgCyP基因在抗肿瘤方面的作用,为抗肿瘤方面提供更多选择。方法:人参RNA通过TRizol法获得,通过RT-PCR增加CyP目的基因,TA克隆、测序基因、真核表达载体构建;农杆菌冻融法转化,农杆菌介导的花卉浸泡法转化拟南芥;潮霉素筛选以及分子鉴定法获得转基因阳性植株;野生拟南芥被用作对照组进行整株分离,对叶子和蛋白质提取物进行抗病性分析;RT-PCR法分析对拟南芥疫病胁迫前后抗病相关基因分析。对植株在培养基中和土壤中进行高盐处理及相关生理指标检测。用CCK8法对三种肿瘤细胞的细胞毒性进行检测。结果:第一,人参CyP目的基因成功扩增,该基因522bp。植物表达载体pCAMBIA1303-CyP构建成功。第二,PCR检测显示目的基因已经整入到拟南芥基因组并转录完成;Western Bolt实验显示了目的基因CyP蛋白成功翻译。第三,转基因植物疫病菌胁迫前后CyP蛋白表达高于野生型(P<0.05);疫病胁迫后,转基因拟南芥植物生长状态优于野生型;转基因植物的离体叶子对人参疫病菌抵抗能力具有更好的抗性;转基因植物的蛋白提取物也可以减慢疫病孢子增长。第四,RT-PCR结果显示疫病菌胁迫前的抗病基因PRs较低并且阳性植物和野生型植物的含量没有明显区别;疫病菌胁迫后PRs含量显著上升,转基因拟南芥PRs含量要比野生型更多(P<0.05)。第五,抗盐实验结果表明:高盐条件下,与野生型相比,转基因拟南芥叶绿素相对含量大幅提高,水丢失率较低,电解质率降低。单位鲜重脯氨酸表达量上升。第六,CCK8法检测结果表明:转基因型拟南芥蛋白对三种肿瘤细胞有抑制作用。结论:人参CyP基因有一定的抗病抗逆抗肿瘤作用。
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