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深静脉血栓形成(Deep venous thrombosis DVT)是常见的外周血管疾病,可导致肢体肿胀、下肢缺血、血栓后综合症,甚至致死性肺栓塞的发生。现在对于DVT的治疗主要是各种抗凝溶栓药物的使用,但效果并不令人满意,同时抗凝药物的副作用可导致机体凝血功能下降、消化道出血、手术患者切口并发症发生。研究人员发现骨髓来源的内皮祖细胞(Bone marrow-derived endothelialprogenitor cells BMEPCs)可以分化为血管内皮细胞,分泌各种促血管生成因子从而促进缺血组织的血管新生。研究证实,EPCs可以归巢到深静脉血栓中促进血栓机化再通。我们实验组前期的研究也发现移植EPCs后可以改善血栓内的微环境,促进急性静脉血栓溶解及慢性血栓再通。但是由于EPCs增殖能力及迁移归巢能力较弱,EPCs的应用受到很大的限制。如何更好的改善EPCs的功能成为广大学者的研究方向。MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNAs,可在转录后水平调控基因表达。研究证明MicroRNAs在血管新生过程中扮演了重要角色。miR-150最初被发现于免疫相关细胞中,控制着淋巴细胞的生长分化。研究发现,miR-150可促进间充质干细胞迁移。单核细胞分泌的miR-150可以提高人微血管内皮细胞迁移及成血管能力。但是,miR-150对于EPCs的功能影响,特别在深静脉血栓再通中的作用却未见相关报道。本实验研究中,我们采用密度梯度离心法分离SD大鼠的骨髓单个核细胞(Bonemarrow-derived mononuclear cells, BMMNCs),EGM-2MV培养基诱导、培养、扩增骨髓源性EPCs并鉴定。体外实验中,我们将对照寡核苷酸和miR-150的模拟物或抑制物采用电转的方法,转染EPCs,探讨miR-150对EPCs的功能影响。为了进一步研究miR-150对EPCs在深静脉血栓机化再通中的作用,我们构建了携带miR-150的慢病毒表达载体并转染到大鼠EPCs中,将转染后的EPCs注入到大鼠深静脉血栓模型中。研究结果发现,过表达miR-150能够促进大鼠EPCs的迁移成管能力,促进EPCs归巢到静脉血栓中,加速血栓的机化再通。我们的研究揭示了miR-150对EPCs功能的影响,可能为深静脉血栓治疗带来新的希望。本实验研究,将分为4个部分。主要研究方法及结果如下。第一部分大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定目的:分离、培养并鉴定大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。方法:采用密度梯度离心方法分离大鼠骨髓单个核细胞,采用内皮培养体系EGM-2培养剂进行诱导分化定向诱导培养14-21天,观察细胞的生长形态变化,结合免疫组化、免疫荧光、流式细胞仪技术检测内皮细胞表面标记及造血干细胞表面标记,采用Matrigel成管实验及DiI-ac-LDL摄取实验检测内皮细胞的功能学特性。结果:新分离的骨髓单个核细胞(BMMNCs)呈圆形,48h后部分细胞开始贴壁,贴壁细胞呈纺锤型形态,细胞集落形成,细胞培养至第10~12天逐渐融合,细胞形态呈现出鹅卵石样改变。DiI-acLDL摄取结果显示,细胞能够吸收DiI-ac-LDL。Matrigel成管实验显示培养的细胞能形成管状、网络状结构。流式细胞仪分析及免疫荧光检测结果显示,细胞主要表达内皮特异性标记物VEGFR、vWF;几乎不表达造血干细胞表面标记CD133。结论:本实验成功地建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定的方法体系。在特定培养体系诱导下,可从大鼠骨髓单个核细胞中获得内皮祖细胞,培养到第10~14天的内皮祖细胞呈现late-EPCs表型特征。第二部分MiR-150对内皮祖细胞功能影响的体外实验研究目的:探讨miR-150对大鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、迁移、及成管能力的影响方法:将miR-150模拟物或抑制剂或阴性对照用电转的方法转染到EPCs中。采用MTT、流式细胞术检测miR-150对EPCs增殖及细胞周期的影响。采用划痕实验、穿膜实验检测miR-150对EPCs运动迁移能力的影响。采用Matrige管腔形成实验检测miR-150对EPCs成血管能力的影响。为了探查miR-150对EPCs功能影响的可能靶基因,我们使用在线microRNA数据库寻找miR-150调控EPCs的潜在靶基因。结果:miR-150对内皮组细胞的增殖及细胞周期没有影响。划痕实验及穿膜实验都证实了miR-150模拟物能够显著促进EPCs的迁移运动能力; miR-150抑制剂则能抑制EPCs的迁移运动能力。过表达miR-150能增强EPCs的成管能力。c-Myb的3’UTR区内有miR-150两个潜在的结合位点。结论:miR-150对细胞增殖及细胞周期没有作用。过表达miR-150促进大鼠EPCs迁移及运动及成管能力。c-Myb可能是miR-150的靶基因。第三部分构建miR-150慢病毒表达载体及其在内皮祖细胞有效性表达目的:构建miR-150慢病毒表达载体,感染大鼠EPCs后检测miR-150的表达,为研究体内条件下miR-150在EPCs中的生物学功能奠定基础。方法:将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的miR-150前体序列pre-miR-150和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl经酶切后连接产生pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150,经酶切及测序鉴定正确后在HEK293T细胞中包装病毒,收集病毒上清后感染EPCs。用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测感染后的EPCs中miR-150的表达。结果:酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150构建正确,病毒上清液感染EPCs后能有效提高miR-150的表达。结论:成功构建了pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150慢病毒表达载体及稳定表达miR-150的EPCs细胞系。第四部分miRNA-150对内皮祖细胞在深静脉血栓再通中的作用目的:探讨miRNA-150对大鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在血栓机化再通中的作用。方法:我们通过结扎大鼠下腔静脉构建深静脉血栓模型,将构建成功的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-IRES-ZsGreen1-miR-150转染到EPCs中并移植到血栓模型中。在术后7天、14天收集标本称重。通过荧光示踪观察EPCs归巢到静脉血栓的情况。采用HE染色,CD34免疫组化染色观察转染miR-150后EPCs对静脉血栓机化再通的影响。为了探查miR-150促进血栓机化再通的可能机制,我们采用免疫组化染色检测血栓中MMP-2的表达情况。结果:移植的EPCs出现在静脉血栓中。EPCs/miR-150组中GFP阳性细胞数目较EPCs/vector组明显增多。EPCs移植后抑制静脉血栓形成,EPCs/miR-150组中静脉血栓的重量最低。HE染色和CD34免疫组化染色提示EPCs促进血栓的机化再通。相对于EPCs/vector组,EPCs/miR-150组中血栓机化再通最为明显。不论在术后7天还是14天,MMP-2在EPCs/miR-150组和EPCs/vecto组的表达皆高于空白对照组。其中,EPCs/miR-150组中MMP-2的表达最为丰富。结论:移植的EPCs可以归巢到静脉血栓中促进血栓溶解。EPCs显著抑制血栓形成,促进血栓的机化再通。miR-150增强了EPCs的归巢能力,促进了EPCs在血栓机化再通中的作用。提高EPCs中miR-150的表达水平可能为DVT的治疗带来希望。