背景应用在卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、宫颈癌和肺癌等癌症化疗中的顺铂,是临床上经典的抗癌药,存在已经有30多年的历史。顺铂主要的靶标是DNA。顺铂进入细胞后发生水化,与DNA交联,由于加合而变形的DNA结构,不能进行正常的复制,继而触发了死亡过程,这种DNA-Pt加合物被认为是引起细胞毒性主要原因。由于顺铂虽然在癌症治疗中效果显著,抗性问题和副作用问题,这也成为顺铂临床治疗的瓶颈。正是对顺铂药物作用机理的研究深入,才出现了后续二代铂类药Oxaliplatin,不会和顺铂产生交叉抗性,以及正在临床三期实验的Satraplatin。说明只有不断地了解顺铂作用机理及抗性产生机制,才能为临床药物设计提供新的策略。目前对顺铂作用机制的研究已很多,但仍有许多问题尚不明确。系统生物学技术作为高通量的分析方法,可以揭示一些未知或未预期的关联。因此,本研究首先采用了蛋白组学方法分析细胞对顺铂的应答反应。考虑到顺铂主要靶标是DNA, DNA损伤后的修复也是发生在细胞核内,在本研究中,我们单独提取了细胞的核蛋白,利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)配合蛋白质谱鉴定分析核内蛋白组的变化。此外,MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,可调控60%哺乳动物的mRNA,继而调控蛋白的变化。有研究表明,P53不但调控一些miRNAs,也被某些miRNAs所调控。鉴于DNA损伤后P53和miRNAs的紧密联系,我们推测miRNAs可能也参与顺铂诱导的DNA损伤反应过程中。本研究的第二部分就是利用了另外一种高通量技术——microRNAs表达谱芯片,从转录水平和翻译后水平以外的另一个层次——转录后调控,探究了顺铂诱导DNA损伤中microRNAs可能发挥的作用。第一部分顺铂诱导DNA损伤的核蛋白质组学分析目的利用双向电泳技术研究顺铂处理HeLa细胞后,细胞核内蛋白组发生的变化,借以挖掘在DNA损伤后细胞一系列应答过程中发挥作用的蛋白。方法1.细胞存活率及DNA损伤的检测,包括Trypan Blue, MTT和免疫荧光及荧光强度的软件分析；2.细胞核蛋白的提取和超滤法纯化和浓缩蛋白,蛋白BCA和Bradford法定量；3.双向电泳联合质谱鉴定；4. Western Blot和荧光实时定量PCR验证双向结果；RNAi技术进行功能鉴定；流式细胞仪检测RNAi后细胞凋亡和DNA损伤；结果1.随着时间延长和浓度的增大,顺铂的细胞毒性和作为DNA双链断裂标志的yH2AX的形成具有明显的时间效应和浓度效应；2.顺铂5μM处理HeLa细胞24 h后,细胞周期明显停滞在S期,其比例从35%上升到86%,相应地,G1期从54%下降到2%,G2期的比例没有发生大的变化,仅从19%下降到12%；顺铂处理组的凋亡比例也从5.7%增加到17.5%；3.顺铂处理HeLa细胞后,在不同时间点通过双向电泳图谱比较发现共有98个点发生改变。进一步质谱鉴定出28个核蛋白点；在这28个核蛋白中,有6个是不同处理组共有的,剩下的22个蛋白在顺铂处理后表达量上调的有12个,表达量下调的有10个；4.用定量PCR, Western blot和免疫荧光方法验证了双向结果中Annexin A1, LaminB1和Hsp27蛋白表达的改变；5.对Annexin A1进行了进一步的功能鉴定,首先用免疫荧光的方法,直观地观察ANXA1干扰后,对yH2AX焦点形成的影响。在5μM顺铂处理组中,与对照组相比,干扰组的yH2AX荧光的荧光强度明显增加；用Western Blot和流式细胞术,检测ANXA1干扰后对细胞DNA损伤的影响,其结果和免疫荧光结果一致。6.在干扰Annexin A1表达后,发现干扰组的自发凋亡比例(37.9%)已高于对照组(23.7%)。顺铂处理后,干扰组和对照组的凋亡比例没有明显差别,分别为54%和52%。结论1.随着时间延长和浓度的增大,顺铂的细胞毒性和yH2AX的形成具有明显的时间效应和浓度效应；2.质谱鉴定出28个核蛋白点,主要参与miRNA生物合成,转录调节,mRNA加工,转运,剪接,细胞周期和分裂,染色体分离,核纤层组成,细胞应答反应,细胞凋亡等过程。3. Annexin A1干扰后,自发凋亡显著上升,顺铂诱导的DNA损伤加重。第二部分顺铂诱导DNA损伤的microRNAs分析目的研究顺铂处理诱导DNA损伤的miRNA表达谱改变,从转录水平和翻译后水平以外的另一个层次——转录后调控系统,揭示顺铂可能的作用机制和细胞应答反应过程。方法提取总RNA(包含microRNAs); Bioanalyzer分析纯度,Nanodrop测定浓度,芯片检测,挑选一批miRNAs进行Real time PCR验证；利用转染,免疫荧光,流式细胞仪,Western blot明确筛选出的miR-191与DNA损伤的关系。结果1.芯片检测发现在顺铂处理后有40个发生了显著改变,并对其中13个miRNAs进行了Real-time PCR验证。2.对鉴定出的miR-191进行了深入研究。发现转染了miR-191mimic的HeLa细胞在顺铂处理12 h和24 h后细胞生存率较对照显著下降；说明miR-191使HeLa细胞对顺铂更敏感。3.在转染了miR-191mimic的HeLa细胞中,已有部分细胞的细胞核被yH2AX充满,而对照组的yH2AX形成较少；经过5μM顺铂处理24 h后,转染了miR-191mimic组大部分细胞的细胞核充满yH2AX,而此时的对照组,仅有少量的细胞核有yH2AX荧光分布。用软件分析了yH2AX的平均荧光强度发现,顺铂处理24 h后,与对照组比较,转染了miR-191mimic组细胞yH2AX的平均荧光强度显著增加。4.利用流式细胞仪和Western Blot进一步确认发现的现象。流式细胞计数检测发现转染了：niR-191mimic的细胞在顺铂处理后的yH2AX的比例由10.5%上升到25.1%,去除基线值,增加了3倍。在Western Blot中,也有相同的趋势存在。结论1.筛选出了一批在顺铂处理后发生改变的miRNAs。2.确定了miR-191和顺铂诱导的DNA损伤之间存在密切的联系；