随着我国老龄化人口的增加,骨质疏松患者数目也在逐年增加。目前,多数己上市的抗骨质疏松药物在发挥疗效的同时仍存在不少副作用,寻找更加安全有效的抗骨质疏松药物的需求尤为迫切。骨质疏松症是一种骨重建异常导致的代谢性骨病,其中成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的失衡是引起骨量丢失和骨结构改变的主要原因。因此,促进成骨细胞分化和/或抑制破骨细胞分化是治疗骨质疏松症的基本策略。RUNX2是调节成骨细胞分化的关键性转录因子,也是多条参与调节成骨细胞分化和骨形成的信号通路的汇聚点。RUNX2转录激活剂可能具有潜在的促进成骨细胞分化和骨形成的效应。NF-κB则是诱导破骨细胞分化的最重要的转录因子,抑制该因子的活性可抑制破骨细胞形成。因此,本课题拟分别利用反映RUNX2转录活性和反映NF-κB转录活性的细胞筛选模型,对小分子化合物库和天然产物库进行筛选,以期发现可促进成骨分化和/或抑制破骨分化的候选阳性化合物,并对其进行体内外抗骨质疏松活性评价和作用机制研究。为了实现这一目标,本研究分为两个部分:一、基于RUNX2转录活性的高通量筛选与化合物T63的抗骨质疏松作用机制研究研究目的:利用基于RUNX2转录活性的细胞筛选模型,完成对小分子化合物库的高通量筛选,并对活性最优的目标化合物T63进行体内外抗骨质疏松的药效学评价和作用机制研究。研究方法:利用荧光素报告基因系统,检测待测化合物对RUNX2转录活性的影响。以多能间充质干细胞样成纤维细胞C3H10T1/2和小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1诱导分化的成骨细胞作为主要研究对象,采用MTT法、p-NPP法、茜素红染色和PCR等方法,分别研究候选化合物T63对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALPL)活性、矿化结节形成和成骨细胞分化相关基因表达的影响,结合Western blot、ChIP和RNAi等技术考察T63对成骨细胞分化相关信号通路的影响。利用流式细胞术和双荧光素报告基因系统分析T63对成骨前体细胞中ROS水平以及雌激素应答元件ERE活性的影响。油红染色和实时定量PCR法检测T63对间充质干细胞向脂肪分化的影响。采用TRAP染色、F-actin染色、PCR和Western blot等方法,分别考察在成骨细胞-破骨细胞共培养体系以及RANKL诱导的破骨细胞模型中,T63对破骨细胞的形成、细胞骨架融合以及破骨分化相关基因表达和信号通路的影响。体内采用卵巢去势联合地塞米松建立的骨质疏松大鼠模型,考察T63对大鼠骨密度、骨体积分数、血清生物标记物等的影响。实验结果:本研究通过对小分子化合物库中20760个化合物进行筛选,发现候选化合物T63可显著上调小鼠成骨细胞模型中RUNX2的转录活性。进一步研究表明,T63在不影响细胞增殖的情况下,能显著上调小鼠成骨细胞ALPL的活性、矿化结节的数目以及成骨分化相关基因Alpl、Bglap、Spp1、Runx2和Bmp2mRNA的表达。T63诱导小鼠成骨细胞分化的作用在人成骨细胞MG63和hFOB1.19中也得到了验证。此外,该化合物也能抑制C3H10T1/2细胞向脂肪细胞分化过程中脂滴的形成和相关基因Pparγ2,Srebf1和Fabp4的表达。T63能上调RUNX2基因和蛋白的表达,增加RUNX2在Alpl基因启动子区的聚集,而对转录因子OSX表达的影响不大。Runx2shRNA能减弱T63诱导的RUNX2活性和成骨细胞分化表型,提示T63的促成骨细胞分化效应有赖于RUNX2的表达。在机制上,T63不仅能上调Bmp2、Bmp4和Bmp7的mRNA的表达、诱导Smad1/5/8磷酸化,还能上调TCF转录活性、诱导GSK-3β磷酸化及增加β-catenin的核转移;而BMPs通路抑制剂Noggin和WNT/β-catenin通路抑制剂DKK-1均可以减弱T63诱导的RUNX2的转录激活和成骨细胞分化表型,提示两条信号通路通过影响RUNX2的活性参与调控了 T63的促成骨细胞分化效应。本研究还发现T63能降低成骨前体细胞内ROS的水平,增强雌激素应答元件ERE的转录活性。在对破骨细胞分化的调节方面,T63不仅抑制共培养体系中成骨细胞介导的破骨细胞的形成,也能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成和破骨分化相关基因的表达,并可抑制Rankl基因表达以及MAPKs和Akt信号通路的活化。体内动物实验结果显示,与骨质疏松大鼠模型组相比,5mg/kg和20mg/kgT63(灌胃给药)可以显著增加模型组的股骨、胫骨和椎骨骨密度,改善骨小梁结构;同时增加模型组血清ALPL水平和股骨横切面成骨细胞的数目,抑制其血清NTX-1水平和股骨横切面破骨细胞的形成。结论:经高通量筛选获得的化合物T63具有良好的体内外抗骨质疏松活性。T63可通过激活BMPs和经典WNT/β-catenin双重信号通路诱导RUNX2转录激活,进而促进成骨细胞分化和骨形成。T63还可通过下调MAPKs和Akt信号通路的活化而抑制破骨细胞分化和功能。该化合物有望发展成为潜在的抗骨质疏松候选药物。二、NF-κB转录活性抑制剂的筛选及秦皮甲素抑制破骨细胞分化效应的研究研究目的:以NF-κB为潜在分子靶标,完成对天然化合物库的初步筛选。对筛选得到的活性化合物秦皮甲素(AES)进行体内外抗骨质疏松活性的评价和机制的研究。研究方法:利用脂质体转染法将含有荧光素报告基因的NF-κB质粒转染进RAW264.7细胞建立反映NF-κB转录活性的细胞筛选模型。利用荧光素报告基因系统检测在细胞筛选模型中天然化合物对荧光素酶活性的影响。MTT法检测筛选得到的阳性化合物AES对RAW264.7细胞毒性作用。TRAP染色、F-actin染色和PCR等方法研究AES对RANKL诱导的破骨细胞形成、融合以及破骨分化相关基因mRNA表达的影响。结合Western blot、双荧光素报告基因系统和基因过表达等技术,研究AES抑制破骨细胞分化的分子机制。利用p-NPP法及茜素红染色等方法,考察AES对MC3T3-E1细胞成骨细胞分化的影响。同上方法采用卵巢去势联合地塞米松建立骨质疏松模型大鼠,研究AES的体内抗骨质疏松活性。实验结果:本研究构建了 NF-κB抑制剂筛选模型,从132个天然化合物中筛选发现AES可有效抑制NF-κB活性。5-20μM kMAES在不产生毒性的同时,能剂量依赖地抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成和F-actin环的形成,同时抑制Trap、Atp6v0d2、Cathepsin K、Mmp-9和Nfatc1等破骨分化相关基因的表达。研究发现,AES不仅能抑制RANKL下游的NF-κB通路,也能抑制MAPKs通路的激活。此外,AES能抑制Rank基因的表达;过表达RANK可以减弱AES对破骨细胞形成和NF-κB活性的抑制作用。AES对成骨细胞分化的影响作用不明显。动物实验结果显示,与骨质疏松大鼠模型组相比,20 mg/kg和100 mg/kg AES可有效升高骨密度及骨体积分数,并降低血清中NTX-1水平。结论:本研究基于NF-κB转录活性建立细胞筛选模型,并从132个天然化合物中筛选得到活性化合物AES。AES能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,抑制骨质疏松模型大鼠骨量的丢失。AES对破骨细胞分化的调节作用可能与AES抑制Rank基因表达、进而影响RANKL下游NF-κB等信号通路有关。