【摘 要】
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目的:利用串联质谱标签（Tandem mass tags,TMT）蛋白质组学技术分析藿朴夏苓汤治疗胃高级别上皮内瘤变（high-grade gastric intraepithelial neoplasia,HGIN）前后差异表达蛋白,筛选出重要信号通路及潜在靶点;建立HGIN大鼠模型,观察藿朴夏苓汤对HGIN大鼠的治疗效果,并探究其作用机制。为临床广泛应用藿朴夏苓汤逆转HGIN提供更确切的科学依
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目的:利用串联质谱标签（Tandem mass tags,TMT）蛋白质组学技术分析藿朴夏苓汤治疗胃高级别上皮内瘤变（high-grade gastric intraepithelial neoplasia,HGIN）前后差异表达蛋白,筛选出重要信号通路及潜在靶点;建立HGIN大鼠模型,观察藿朴夏苓汤对HGIN大鼠的治疗效果,并探究其作用机制。为临床广泛应用藿朴夏苓汤逆转HGIN提供更确切的科学依据和坚实的理论基础。方法:1.收集3例HGIN患者经藿朴夏苓汤治疗前后的胃组织,借助高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）平台对两组组织中的蛋白进行TMT标记定量分析,并通过生物信息学分析鉴定到的差异蛋白,探讨病变阶段效应分子,筛选重要信号通路。2.选取35只6周龄SPF级Wistar大鼠,随机抽取5只大鼠正常饲养作对照,其余30只大鼠均采用以N-甲基-Nˊ-硝基-N-亚硝基胍（n-methyl-n’-nitro-n-nitroso-guanidin,MNNG）为主的复合造模法制备HGIN大鼠模型。具体如下:每日给予200μg/ml的MNNG按5ml/kg/d灌胃,并配合饮食失常（2天饱食、1天禁食）,饱食时配合0.3g/kg雷尼替丁和60℃热盐水（浓度为150g/L）混合液按10ml/kg/d灌胃,禁食时配合40%的乙醇按1ml/只灌胃,连续灌胃14周后模型制备结束。分别在造模8、10、12、14周时间节点时随机处死2只大鼠,取胃组织进行病理检测,同时采用免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）检测特异性标志物黏蛋白1（mucin 1,MUC1）、尾型同源盒转录因子2（caudal type homeobox2,CDX2）。3.造模结束后给予藿朴夏苓汤的干预治疗,随机分为5组:对照组（Control）、模型组（Model）、藿朴夏苓高剂量组（HPXL-H）、藿朴夏苓低剂量组（HPXL-L）和维酶素组（VIT）,灌胃治疗8周。4.实验结束后,观察大鼠的一般状态,处死大鼠,取胃窦部组织染色（苏木精伊红染色法,HE染色）后镜下观察各组大鼠胃黏膜的病理改变;免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A,LDHA）、葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporter 1,GLUT1）、己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）、丙酮酸激酶2（Pyruvate Kinase M2,PKM2）的表达。免疫印迹法（Western Blot）和实时定量聚合酶链式反应（Real‐time Quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）法检测胃黏膜组织PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白的表达。结果:1.临床应用藿朴夏苓汤治疗HGIN患者并成功逆转,临床疗效显著;2.TMT蛋白质组学分析结果显示共鉴定出4832个蛋白,其中存在差异表达的蛋白有492个,并依据蛋白FDR可信度和在每个样品中表达丰度筛选出差异表达蛋白292个,包括111个上调差异蛋白和181个下调差异蛋白。生物信息学分析显示代谢通路为主要调控通路,其中糖代谢差异蛋白富集最多;3.与对照组比较,模型组的大鼠胃黏膜MUC1表达降低,CDX2表达增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;4.与模型组比较,藿朴夏苓高、低剂量组GLUT1、LDHA、PKM2的表达降低,HK2的表达增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;5.与模型组比较,藿朴夏苓高、低剂量组AKT、PI3K、p-AKT、m TOR和HIF-1α的蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;6.与模型组比较,藿朴夏苓高、低剂量组PI3K、AKT、m TOR、HIF-1αm RNA的表达显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.藿朴夏苓汤可以逆转HGIN,临床疗效显著。2.藿朴夏苓汤可以逆转HGIN大鼠胃黏膜病理学病变,阻断HGIN的恶性进展。3.藿朴夏苓汤可以有效纠正HGIN的糖代谢紊乱,从而达到防治HGIN癌变的目的。4.藿朴夏苓汤通过PI3K/AKT/m TOR信号通路逆转HGIN大鼠胃黏膜病理学病变,阻断胃癌的发生。
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