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目的:卵巢是女性主要生殖器官之一,卵泡的发育过程中,颗粒细胞和卵泡膜细胞合成的物质对其进行调控。颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖或功能减退可导致卵泡闭锁增加,从而加速了绝经期的到来,即缩短了妇女的生殖期,导致卵巢功能早衰。本研究拟通过细胞实验,以顺铂(cis-Diaminedichloroplatinum,CDDP)作为卵巢颗粒细胞损伤因素建立化疗源性卵巢颗粒细胞损伤模型,观测四物合剂药理血清对损伤后颗粒细胞分泌E2水平、E2合成关键酶Cyp19al基因表达水平及其基因表达调控通路TGF-β3—Smad3—SF-1的影响,明确四物合剂药理血清对顺铂损伤后卵巢颗粒细胞E2分泌功能的作用效果,揭示其作用机制,从而为四物合剂在临床上用于卵巢早衰的治疗提供实验依据。方法:1.四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al活性及表达卵巢颗粒细胞是卵巢雌激素合成分泌的主要细胞,通过放免法测定细胞培养过程中上清液E2水平,观察顺铂损伤后下和四物合剂药理血清的干预后颗粒细胞分泌E2水平的变化,明确四物合剂药理血清干预顺铂损伤后的卵巢颗粒细胞中Cyp19al活性的作用。E2合成原料为胆固醇,在一系列酶作用下合成雄烯二酮(Androstenedione)转运至颗粒细胞,颗粒细胞中的芳香化酶(Aromatase,Cyp19al)和17β-类固醇脱氢酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase,17 β-HSD)以雄烯二酮为底物催化生成 E2,其中Cyp19al是E2合成过程及其重要的限速酶。因此本实验通过蛋白印迹和RT-PCR从蛋白质和mRNA水平观察四物合剂干预后顺铂损伤后下的颗粒细胞中Cyp19al的表达变化,从而了解四物合剂影响颗粒细胞E2分泌的机制。2.四物合剂药理血清对SF-1激活Cyp19al基因启动子的干预效果Smad3与SF-1共同作用从而促进SF-1与Cyp19al的PII区域结合来调节Cyp19al的表达。利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,观察四物合剂药理血清对SF-1激活CyP19al基因启动子的干预效果,实验以SF-1抗体结合颗粒细胞的内源性SF-1蛋白,因SF-1蛋白与Cyp19al PII启动子结合,因而在用微珠结合SF-1抗体时可将Cyp19al PII片段提出,经超声断裂后以PCR凝胶电泳检测CyP19al PII的含量,即可了解各组细胞中SF-1启动Cyp19al表达的效果。通过免疫共沉淀实验(CoIP),以SF-1抗体作为免疫共沉淀抗体,Smad3抗体作为免疫印记抗体,通过观察经SF-1特异性沉淀得到的Smad3水平的变化,了解四物合剂药理血清对干预顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中,Smad3与SF-1结合从而增强SF-1激活Cyp19al基因启动子的影响效果。3.四物合剂药理血清通过TGF-β3通路干预顺铂损伤后颗粒细胞Cyp19al的活性及表达TGF-p3与受体结合后通过募集并磷酸激活下游的Smad2或Smad3,被激活的Smad3与Co-Smad4结合形成复合体,复合体向核内转运,调控某些基因的表达,Cyp19al即为其靶基因之一。经TGF-β3活化后的Smad3(p-Smad3)入核后,通过其MH2结构域介导与转录因子类固醇生成因子1(Steroidogenic factor 1,SF-1)的相互作用,增强SF-1与Cyp19al启动子的结合提高其转录活性,进而促进Cyp19al的表达和E2的分泌。实验在药理血清干预过程中加入外源性TGF-β3细胞因子刺激颗粒细胞,或加入Smad蛋白阻断剂SB431542阻断Smad蛋白磷酸化,观察四物合剂药理血清对顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中Cyp19al活性及表达的干预效果。首先,放免法检测各组细胞E2分泌水平,明确四物合剂药理血清通过TGF-β3信号通路干预顺铂损伤后大鼠卵巢颗粒细胞中E2分泌的影响;其次,免疫组化法检测四物合剂药理血清干预顺铂损伤后各组颗粒细胞中Cyp19al表达,明确四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al的活性及表达与TGF-p3信号通路的关系。结果:1.放射性免疫法检测各组颗粒细胞上清液中E2水平,顺铂组颗粒细胞E2分泌水平下降,与顺铂组相比,四物合剂药理血清干预后,细胞中上清液中E2水平明显上升;Western Blot、RT-PCR结果显示四物合剂药理血清组Cyp19al蛋白、mRNA表达水平高于顺铂模型组;2.ChIP实验结果显示,顺铂模型组Cyp19al PⅡ相对表达水平最低,四物合剂干预后Cyp19al PⅡ相对表达水平升高。CoIP实验结果显示,与顺铂模型组相比,四物合剂组Smad3相对表达水平明显升高;3.加入外源性TGF-β3刺激颗粒细胞后,与未加入TGF-β3时比较,四物合剂药理血清干预的顺铂损伤后颗粒细胞E2分泌水平上升,而加入阻断剂后,四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞E2分泌水平下降;免疫组化结果显示,TGF-β3组Cyp19al在蛋白质水平上表达高于未加TGF-β3组,而在加入阻断剂后,四物合剂药理血清干预的顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al表达水平下降。结论:1.四物合剂药理血清可干预Cyp19al基因表达而促进顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞E2分泌。2.四物合剂药理血清能促进顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中SF-1激活Cyp19al基因启动子的转录从而调节Cyp19al表达,且促进了 Smad3与SF-1协同作用影响Cyp19al基因的转录。3.四物合剂药理血清能影响TGF-β3调节其靶基因Cyp19al的活性与表达,这一过程可能与TGF-β3—Smad3—SF-1信号转导通路有关。