枣树ZjPIP2、ZjGPX和ZjMT基因的序列分析与表达研究

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不同植物对逆境胁迫具有不同的耐受性,不同的耐受性产生于进化过程中形成的基因应激调控机制。克隆和研究抗逆性基因对于我们了解植物的抗逆机制和改良植物品种具有重要的意义。枣树(ZiziphusjujubaMill)原产于我国黄河流域,它耐寒,抗旱,抵御各种外界不良因子的能力强,尤其是对土壤瘠薄、干旱的忍耐力显著优于其它农作物。因此,枣树的抗逆性基因是非常宝贵的遗传资源,为了挖掘和研究枣树有关抗逆基因,本研究以壶瓶枣为试材,从其结果枝cDNA文库中筛选并克隆获得了水通道蛋白基因、谷胱甘肽过氧化物酶基因、金属硫蛋白基因,分别对这些基因的序列进行了生物信息学分析,构建了相应的原核及植物表达载体,并进行了相关表达研究及初步的功能验证。  (1)枣树水通道蛋白基因(ZjPIP2)的序列分析与表达研究:从枣树结果枝cDNA文库中筛选获得了一个水通道蛋白基因,用生物信息学软件对该基因cDNA序列进行分析,分析结果表明此序列全长为846bp,编码281个氨基酸,分子量为29.87KD,pI值为8.77;具有膜蛋白家族的保守氨基酸序列“HINPAVTFG”和两个“NPA”保守肽段;与已知的其它植物的质膜膜内蛋白PIP2具有极高的同源性,将其命名为ZjPIP2(DDBJ/EMBL/GenBank的注册号为:AB530493)。利用基因重组技术将ZjPIP2构建至原核表达载体pGEX-4T-1及植物表达载体pBI121。通过热激法将原核表达载体pGEX-4T-1-ZjPIP2转入E.coliBL21,构建了原核表达菌株pGEX-4T-1-ZjPIP2-B。通过冻融法将植物表达载体pBI121-ZjPIP2转入根癌农杆菌LBA4404获得了工程菌pBI121-ZjPIP2-L;该工程菌侵染拟南芥获得转ZjPIP2基因拟南芥植株。对壶瓶枣树苗进行干旱、NaCl胁迫后进行RT-PCR分析结果表明,胁迫诱导了ZjPIP2的表达。  (2)枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因(ZjGPX)的序列分析与表达研究:利用生物信息学软件对已获得的谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA序列进行分析,结果表明该cDNA序列的全长为510bp,编码169个氨基酸,分子量为19.26KD,pI值为5.00,具有一个谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性位点“GKvLLIvNVaSkCGmT”及一个保守肽段“LAFPCNQF”,与其他植物的GPX有极高的同源性,将其命名为ZjGPX;它与白杨树的GPX(2p5rA)有相似的三维结构。将ZjGP基因片段构建至原核表达载体pGEX-4T-2,获得了原核表达载体pGEX-4T-2-ZjGPX;将其转入E.coliBL21后获得了工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B;经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析证明,pGEX-4T-2-ZjGPX-B表达了大小约为45KD的融合蛋白GST-ZjGPX。并利用GST标签蛋白纯化树脂纯化获得GST-ZjGPX融合蛋白。对壶瓶枣树苗进行干旱、NaCl胁迫后的RT-PCR结果表明,ZjGPX在一定的环境胁迫被诱导表达。  (3)枣树金属硫蛋白基因(ZjMT)植物表达载体的构建与功能分析:根据已获得的枣树金属硫蛋白基因ZjMT的cDNA序列设计并合成特异性引物,PCR扩增出ZjM基因片段,并将其构建于植物表达载体PEZR(K)-LNY。冻融法将植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjMT转入根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌PEZR(K)-LNY-ZjMT-L;工程菌株转化拟南芥,并获得转ZjMT因拟南芥植株。对转ZjMT基因植株的细胞学观察表明,转基因拟南芥植株的表皮细胞和气孔保卫细胞核有表达。形态学观察结果表明,转基因拟南芥植株有不育的表型发生。
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