结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。根据2018年的最新数据,结肠癌的发病率位居世界第三位,死亡率居第二位。治疗结肠癌的传统方法主要是手术结合术后化疗。其易复发,毒性大,副作用大是癌症患者死亡的最大原因。天然产物因其具有无毒无副作用,对于肿瘤的治疗具有显著效果。因此,包括多酚,白藜芦醇,青蒿素等在内的,从植物中提取的天然产物已成为人们关注的热点。沙棘,又称为醋柳,为胡颓子科沙棘属多年生落叶灌木或小乔木,主要分布在欧亚大陆的广大地区,在我国主要分布于华北、西北、西南等地。沙棘是非常珍贵的药食同源植物,于1977年首次被列入《中华人民共和国药典》。《中医大辞典》记载沙棘果具有活血散瘀,补脾健胃,生津止渴,清热止泻之功效。研究显示,沙棘的果实、叶和种子中均含有丰富的营养物质和生物活性成分,如多种维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸、黄酮类、微量元素和5-羟色胺等。特别是沙棘及沙棘叶中富含的多酚类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤等医药功能,对多种慢性病具有良好的预防作用。植物多酚作为自然界中大量存在的物质,非常易得,更难得的是无毒无害,具有抗菌抗炎,抗病毒,降压降脂,预防糖尿病,心脑血管疾病等多种慢性疾病以及抗肿瘤的生物活性,具有开发成为肿瘤药物的潜能。沙棘叶富含多酚类化合物,提取和定性沙棘叶中黄酮类物质的研究已很多,但关于沙棘叶中酚酸类,特别是结合态酚酸的成分组成尚无系统报道,因此,本研究以沙棘叶结合态性多酚为研究对象,从植物多酚调控肿瘤糖代谢的角度阐释沙棘叶结合态多酚抗肿瘤的活性及分子机制,为其成为治疗结肠癌的药物提供理论依据。研究内容和结果主要包括以下几个方面:(1)沙棘叶自由态多酚的提取及活性鉴定。采用不同的溶剂对自由态多酚进行高效率提取,为了得到对于沙棘叶自由态多酚的提取效果最好的溶剂,实验采用了80%甲醇,80%乙醇,80%丙酮,80%乙酸乙酯四种有机溶剂和水一共五种不同溶剂进行沙棘叶自由态多酚的提取;采用Folin-Ciocalteu比色法测定自由态态多酚的含量,结果发现甲醇的提取效率最高;采用MTT法分别检测上述不同溶剂提取的提取物对肿瘤细胞HCT-116增殖的影响,比较它们的抗肿瘤效应的活性,筛选出甲醇提取物的抗肿瘤效应最佳。(2)沙棘叶结合态多酚的提取及活性鉴定。沙棘叶结合态多酚的提取采用了酸解法和碱解法两种水解方法对结合态多酚进行高效率提取。从甲醇提取游离态多酚后的残渣中提取沙棘叶结合态多酚;采用Folin-Ciocalteu比色法测定结合态多酚的含量,比较了酸水解和碱水解两种方法对沙棘叶结合态多酚的提取效果,结果发现碱解法对于沙棘叶结合态多酚的提取具有更好的效果。采用MTT法分别检测上述两种水解方法提取的提取物对肿瘤细胞HCT-116增殖的影响,比较它们的抗肿瘤效应的活性,筛选出碱水解提取物的抗肿瘤效应最佳。(3)采用大孔树脂对沙棘叶结合态多酚进行分离纯化;采用高效液相色谱仪将纯化得到的沙棘叶结合态多酚进行组分分离和鉴定;确定沙棘叶结合态多酚成分中发挥抗肿瘤效应的活性成分范围。采用MTT法分别检测上述纯化分离的各成分对肿瘤细胞HCT-116增殖的影响,确定得到抗肿瘤效应的活性成分的方案。(4)阐明沙棘叶结合态多酚通过调控PKM选择性剪接逆转Warburg效应发挥抗肿瘤作用的分子机制。加入不同浓度的沙棘叶结合态多酚处理细胞,采用试剂盒检测沙棘叶结合态多酚对细胞丙酮酸消耗量、乳酸产量和ATP生成量的影响。采用Western blot技术检测沙棘叶结合态多酚处理细胞后,调控PKM选择性剪接的剪接因子hnRNPA1、hnRNPA2、PTB的表达情况,确定沙棘叶结合态多酚处理后表达量显著降低的剪接因子和蛋白PKM1及PKM2的表达水平。综上,沙棘叶结合态多酚能够通过逆转Warburg效应发挥作用,达到抑制结肠癌细胞增殖的作用,沙棘叶结合态多酚通过影响PKM的剪切因子,选择性剪切,进而影响PKM的表达来发挥抑制结肠癌的能力;因此,从沙棘叶中分离获得具抗肿瘤效应的活性多酚物质,从能量代谢重塑的角度阐明其发挥抗肿瘤效应的分子机制,使当地的野生沙棘资源得到充分利用,为其深度开发,成为抗肿瘤药物提供理论依据。